(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210295156.1 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 中国农业科 学院农业基因 组研究所 地址 518210 广东省深圳市大鹏新区鹏飞 路7号 (72)发明人 施传琳　费启立　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01)C12Q 1/6895(2018.01) G01N 33/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于AGO1d基因编辑创建的水稻雄性低温温 敏不育系及其应用 (57)摘要 本发明涉及水稻育种技术领域， 尤其涉及基 于AGO1d基因编辑创建的水稻雄性低温温敏不育 系及其应用。 本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑 技术敲除水稻AGO1d基因， 发现突变植株在22℃ 以下低温花药育性丧失但雌蕊育性正常， 而在28 ℃～30℃花药育性恢复正 常， 通过该方法可获得 水稻雄性 温敏不育系植株， 用于水稻两系法杂交 育种。 先前的两系法杂交制种分别借助于光敏不 育和高温温敏不育， 杂交制种的地域范围受到该 不育系的限制。 目前， 对于低温温敏不育少有报 道， 而本发 明低温温敏不育系的创建不仅扩展了 温敏不育系的创建种类， 而且拓展了杂交稻的制 种地域范围， 从而促进了两系法杂交稻的生产和 应用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图1页 CN 114773442 A 2022.07.22 CN 114773442 A 1.如下I)～V)中的至少一种作为敲除和/或敲低的靶标， 在制备水稻雄性低温温敏不 育系中的应用； I)、 AGO1d蛋白； II)、 AGO1d蛋白的氨基酸序列中经取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且与AGO1d蛋白 具有相同或相近功能的蛋白； III)、 编码I)或I I)所述蛋白的核酸分子； IV)、 在III)所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、 缺失或添加一个或多个核苷酸， 且 能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子； V)、 能够提高I)～ V)中的至少一种的水平或活性的物质。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特 征在于， 所述AGO1d蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 编码SEQ ID NO:1所示蛋白的核酸分子的序列如SEQ  ID NO:2所示。 3.构建水稻雄性低温温敏不育系的制剂， 其特征在于， 包括如下i)～vi)中的至少一 种： i)、 敲除或敲低AG O1d基因的质粒 载体； ii)、 含有i)的重组宿主； iii)、 干扰AG O1d基因转录的核酸分子； iv)、 AGO1d基因表达的终止 子或转座子； v)、 抑制AG O1d基因表达的制剂； vi)、 AGO1d蛋白活性抑制剂。 4.根据权利要求3所述的制剂， 其特征在于， 所述敲除或敲低基因的质粒载体为水稻 AGO1d基因编辑载体， 其 敲除靶点具有如SEQ  ID No.2所示的核酸序列。 5.一种构建水稻雄性低温温敏不育系的方法， 其特征在于， 以权利要求3或4所述的制 剂， 敲除或敲低AGO1d基因的表达、 干扰AGO1d基因转录、 降低植物内源AGO1d蛋白的水平或 降低植物内源AG O1d蛋白的活性。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 所述 敲除或敲低AG O1d基因的表达包括： (1)、 构建水稻AG O1d基因编辑载体， 所述基因编辑的靶点序列如SEQ  ID NO.2所示； (2)、 进行 水稻遗传转 化， 获得转基因植株。 7.水稻育种的方法， 其特 征在于， 包括： 在22℃以下， 将权利要求5或6构建获得的AG O1d敲除植株作为 不育母本； 和/或在28℃～3 0℃， 将权利要求5或6构建获得的AG O1d敲除植株作为可育品种。 8.一种检测水稻雄 性低温温敏不育系植株的试剂盒， 其特 征在于， 包括： 检测AGO1d基因转录水平的制剂； 和/或检测AG O1d蛋白的表达水平或活性制剂。 9.根据权利 要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括AGO1d基因的检测引物， 所述引物具有如SEQ  ID No.3和/或SEQ  ID No.4所示的序列。 10.一种鉴定水稻雄性低温温敏不育系的方法， 其特征在于， 以权利要求8～9所述的试 剂盒检测植物种质的AG O1d基因转录水平或检测AG O1d蛋白的表达水平或活性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114773442 A 2基于AGO1d基因编辑创建的水稻雄性低温 温敏不育系及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及水稻育种技术领域， 尤其涉及基于AGO1d基因编辑创建的水稻雄性低 温温敏不育系及其应用。 背景技术 [0002]杂交稻(hybrid  rice)指选用两个在遗传上有一定差异， 同时它们的优良性状又 能互补的水稻品种进 行杂交， 生产具有杂种优势的第一代杂交种， 就是杂交水稻。 杂交稻在 粮食产量上远高于常规水稻的特征使得杂交稻在农业生产和保 障国家粮食安全上具有重 要意义。 然而， 杂交稻遗传上具有高度杂合性， 杂种后代出现性状 分离， 丧失杂种优势， 因此 杂交稻需要年年制种， 同时由于水稻属自花授粉植物， 这为杂交制种又带来了困难。 目前生 产上主要采用三系法和两系法进行水稻杂交制种， 三系法只要是指雄性不育系、 保持系和 恢复系， 通过利用雄性不育系花粉不育但雌蕊正常的母水稻， 人工授粉恢复系的花粉获得 育性恢复的杂种后代， 从而获得杂种优势， 而通过将不育系与保持系杂交而获得雄性不育 的后代。 两系法是对三系法的创新和突破， 通过选用光/温敏不育系作为母本， 借助光/温敏 不育系在一定环境下可育与不育的转变， 分别实现与恢复系父本进行杂交制种和自交繁殖 的目的。 目前的育种方法是特异 性差、 敏感度低、 成本高、 产率低、 合格率低、 反应速度 慢、 有 副作用、 效果差、 使用不方便等类似问题。 发明内容 [0003]有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供基于AGO1d基因编辑创建的水稻雄 性低温温敏不育系及其应用。 [0004]本发明提供了如下I)～V)中的至少一种作为敲除和/或敲低的靶标， 在制备水稻 雄性低温温敏不育系中的应用， [0005]I)、 AGO1d蛋白； [0006]II)、 AGO1d蛋白的氨基酸序列中经取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且与AGO1d 蛋白具有相同或相近功能的蛋白； [0007]III)、 编码I)或I I)所述蛋白的核酸分子； [0008]IV)、 在III)所述核酸分子的核苷酸序列中经取代、 缺失或添加一个或多个核苷 酸， 且能编码相同或相似功能蛋白的核酸分子； [0009]V)、 能够提高I)～ V)中的至少一种的水平或活性的物质。 [0010]本发明中所述AG O1d蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 [0011]本发明中所述编码SEQ  ID NO:1所示蛋白的核酸分子的序列如SEQ  ID NO:2所示。 [0012]水稻(Oryza  sativa L.)基因组编码了19个AGO蛋白家族成员， 此前， 有报道称 OsAGO1b和OsAGO1d的转录本在花药壁中高表达， 但没有证据表明AGO蛋白家族成员， 特别是 OsAGO1d能够参与调控花药壁和花粉育性。 本发明研究表 明， 敲除AGO1d基因的水稻突变植说　明　书 1/5 页 3 CN 114773442 A 3