(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210303672.4 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 苏州淦江生物技 术有限公司 地址 215151 江苏省苏州市高新区富春江 路188号1号楼1 103室 (72)发明人 杨尧　张鲁军　郭翠　韦淑杯　 张伟　戴国华　王庆　张燕娜　 李旭卉　纳洋　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 黄爽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测MMACHC基因突变位点的引物探针及试 剂盒 (57)摘要 本发明提供一种检测MMACHC基因突变位点 的引物探针及试剂盒， 可同时检测MMA CHC基因的 14个突变位点， 包括c.1A>G、 c.81+1G>A、 c.217C> T、 c.315C>G、 c.365A>T、 c.394C>T、 c.445 ‑ 446delTG、 c.481C>T、 c.482G>A、 c.565C>A、 c.567dupT、 c.609G>A、 c.626_627delTG和c.658 ‑ 660delAAG。 本发明高效便捷， 一次检测通过3个 扩增反应体系检测14个MMA CHC突变位点。 通过相 邻双探针系统增强检测 信号， 灵敏度达1ng， 实现 微量血样样本检测多个MMA CHC基因突变位点， 有 利于新生儿筛查检测。 权利要求书2页 说明书12页 序列表5页 附图10页 CN 114790480 A 2022.07.26 CN 114790480 A 1.检测MMACHC基因突变位点的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括检测c.1A>G和 c.81+1G>A位点的引物对I， 检测c.217C>T位点的引物对II， 检测c.315C>G、 c.365A>T和 c.394C>T位点的引物对III， 检测c.445_446delTG和c.481C>T、 c.482G>A位点的引物对IV， 检测c.565C>A、 c.567dupT、 c.6 09G>A、 c.626_627delTG和c.6 58_660delAAG位点的引物对V； 引物对I包括如SEQ  ID NO:1所示的上游引物和如SEQ  ID NO:2所示的下游引物； 引物对II包括如SEQ  ID NO:3所示的上游引物和如SEQ  ID NO:4所示的下游引物； 引物对III包括如SEQ  ID NO:5所示的上游引物和如SEQ  ID NO:6所示的下游引物； 引物对IV包括如SEQ  ID NO:7所示的上游引物和如SEQ  ID NO:8所示的下游引物； 引物对V包括如SEQ  ID NO:9所示的上游引物和如SEQ  ID NO:10所示的下游引物。 2.与权利要求1所述引物组配套使用的探针， 其特征在于， 包括突变检测探针和锚定探 针； 其中， 突变检测探针5 ’端标记荧光基团， 且3 ’端进行C3  Spacer修饰， 同时锚定探针3 ’端 标记荧光淬灭基团； 或者， 突变检测探针3 ’端标记荧光基团， 同时锚定探针5 ’端标记荧光淬 灭基团， 且3 ’进行C3 Spacer修饰； c.1A>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:11和12 所示； c.81+1G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:13和 14所示； c.217C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:15和 16所示； c.315C>G位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:17和 18所示； c.365A>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:19和 18所示； c.394C>T位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:20和 21所示； c.445_446delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO:22和23所示； c.481C>T、 c.482G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO:24和23所示； c.565C>A和c.567dupT位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ   ID NO:25和26所示； c.609G>A位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:27和 26所示； c.626_627delTG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO:28和2 9所示； c.658_660delAAG位点对应的突变检测探针和锚定探针的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO:30和31所示。 3.根据权利要求2所述的探针， 其特征在于， 所述荧光基团选自FAM、 HEX、 CY5、 ROX中的 至少一种， 所述 荧光淬灭基团选自BHQ1、 BHQ2、 BHQ3中的至少一种。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114790480 A 24.MMACHC基因突变位点检测试剂盒， 其特征在于， 包括前处理液、 扩增反应液和突变检 测液， 所述 突变检测液选自突变 检测液A、 突变 检测液B、 突变 检测液C中的至少一种； 所述前处 理液为： 5％C helex‑100+0.2M NaOH； 所述扩增反应液为： 0.5 ‑2U热启动Taq酶、 0.05 ‑0.2U UNG酶、 1‑10nmol dNTP、 1‑10nmol  dUTP和5ul  5×PCR缓冲液； 其中， 所述5 ×PCR缓冲液由pH  8.8的150 ‑350mM Tris‑HCl、 10‑ 20mM MgCl2、 0.5‑2.5％BSA、 0 ‑15％甘露醇， 20‑80mM(NH4)2SO4、 0‑0.05％Tween20和5 ‑25％ 海藻糖组成， 以水配制； 所述突变检测液A为： 如SEQ  ID NO:1所示的引物1.5pmol、 如SEQ  ID NO:2所示的引物 20pmol、 如SEQ  ID NO:7所示的引物1pmol、 如SEQ  ID NO:8所示的引物10pmol、 如SEQ  ID  NO:11所示的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:13所示的探针7.5pmol、 如SEQ  ID NO:22所示的探针 5pmol、 如SEQ  ID NO:24所示的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:12所示的探针5pmol、 如SEQ  ID  NO:14所示的探针7.5pmo l和如SEQ ID NO:23所示的探针5pmo l， 以水配制； 所述突变检测液B为： 如SEQ  ID NO:5所示的引物1pmol、 如SEQ  ID NO:6所示的引物 10pmol、 如SEQ  ID NO:9所示的引物1pmol、 如SEQ  ID NO:10所示的引物0.4μM、 如SEQ  ID  NO:17所示 的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:19所示的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:20所示 的探针 5pmol、 如SEQ  ID NO:28所示的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:18所示的探针5pmol、 如SEQ  ID  NO:21所示的探针5pmo l和如SEQ ID NO:29所示的探针5pmo l， 以水配制； 所述突变检测液C为： 如SEQ  ID NO:3所示的引物1.5pmol、 如SEQ  ID NO:4所示的引物 15pmol、 如SEQ  ID NO:9所示的引物1pmol、 如SEQ  ID NO:10所示的引物10pmol、 如SEQ  ID  NO:15所示 的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:25所示的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:27所示 的探针 5pmol、 如SEQ  ID NO:30所示的探针5pmol、 如SEQ  ID NO:16所示的探针5pmol、 如SEQ  ID  NO:26所示的探针5pmo l和如SEQ ID NO:31所示的探针5pmo l， 以水配制。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114790480 A 3