(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210307212.9 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 云南省寄生虫病防治所 地址 665000 云南省普洱 市思茅区西园路6 号 (72)发明人 谢吕　周红宁　李曼　姜进勇　 赵晓涛　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 张换君 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 蚊传黄病毒属特异性qPCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了蚊传黄病毒属特异性qPCR检 测方法， 属于分子生物学和核酸检测技术领域。 本发明公开了一种检测蚊传黄病毒属病毒的引 物组， 所述引物组包括核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示的上游引 物和SEQ ID NO： 2所示的下游引 物。 该引物组是根据12种蚊传黄病毒基因的保守 区域设计获得的， 对多种蚊传黄病毒基因扩增具 有良好的实用价值， 实现了用1对引物对12种蚊 传黄病毒的同时定性检测， 极大地降低了检测成 本同时提高了检测通量， 为蚊传黄病毒属病毒的 快速高效检测提供了有效的新工具。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图17页 CN 114540552 A 2022.05.27 CN 114540552 A 1.一种检测蚊传黄病毒属病毒的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括核苷酸序列如 SEQ ID NO： 1所示的上游引物和SEQ  ID NO： 2所示的下游引物。 2.一种检测蚊传黄病 毒属病毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1所述 的引物组。 3.一种检测蚊传黄病毒属病毒的qPCR方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)以待测样品cDNA为模板； (2)利用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增， 获取扩增产物； (3)对扩增产物进行 熔解曲线分析， 判断待测样品类型。 4.根据权利 要求3所述的检测蚊传黄病毒属病毒的qPCR方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述PCR扩增反应体系包括以下组分： 2XPCR  buffer 10 μl， 上下游引物浓度均为400nM， 用 量各0.8 μl， cDNA模板1 μl， d dH2O补足至20 μl。 5.根据权利 要求3所述的检测蚊传黄病毒属病毒的qPCR方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述PCR扩增反应程序为： 95℃90s， 1次循环； 95℃5s， 51℃15s， 72℃3 0s， 35次循环。 6.根据权利 要求3所述的检测蚊传黄病毒属病毒的qPCR方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述熔解曲线分析程序为： 6 5℃‑95℃， 每0.0 5秒升高0.5℃， 连续采集 荧光。 7.根据权利要求3所述的检测蚊传黄病 毒属病毒的qPCR方法， 其特征在于， 若熔解曲线 出现特异熔解峰， 可判断待测样品为蚊传黄病毒属病毒。 8.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在制备检测蚊传黄病毒属病毒 感染产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540552 A 2蚊传黄病毒属特异性qPCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域， 特别是涉及蚊传黄病毒属特异性 qPCR检测方法。 背景技术 [0002]黄病毒科黄病毒属虫媒病毒包括黄热病病毒(yellow  fever virus,YFV)、 寨卡病 毒(Zika virus,ZIKV)、 乙型脑炎病毒(Japanese  encephalitis  virus,JEV)、 登革病毒 (dengue virus,DENV)、 西尼罗河病毒(West  Nile virus,WNV)、 坦布苏病毒(Tembisa   virus， TBV)、 巴格扎病毒(Baraza  virus， BGV)、 以色列火鸡脑膜炎病毒(Israel  turkey  meningoencephalomyelitis  virus， ITV)、 乌苏土病毒(Usutu  virus， UVSV)、 斯庞德温尼病 毒(Sodwana  virus， SPONV)、 伊利乌斯病毒(Ileus  virus， ILHV)、 罗西欧病毒(Rocio   virus， ROCV)等。 这些病毒通过蚊子叮咬传播,引起发热、 皮疹、 皮肤黏膜出血、 脑炎、 新生儿 畸形等多种疾病， 其中， D ENV广泛流行于全球热带和亚热带地区， 特别是东南亚、 西太平洋、 中南美洲和非洲的100多个国家和地区； YFV主要在非洲流行,但近年来其传播范围不 断扩 大， 亚洲已有多次输入病例报道； ZIKV主要在在非洲和南美洲流行， 但 东南亚已有多次暴 发 流行； WNV的流行范围也 从北美洲扩 大到亚洲、 欧洲； 此外， JEV主要流行于亚洲地区， 但每年 的感染者近7万人， 其他几种病毒因未进 行常规检测而鲜有报道。 上述疾病的临床特征高度 相似， 临床治疗以对症支持治疗为主且预防控制均以防蚊灭蚊为主要措施， 故即使无法或 无需对上述病原体进 行定种特异 性检测， 一种能同时对上述多种病原体进 行定属通用检测 的方法也将极大的有利于上述疾病的预防控制和治疗。 此外， 鉴于疾病预防控制的需要， 各 地卫生健康部门每年均需对这些疾病的病原体进 行大规模监测， 包括不明原因发热病人血 清及媒介中病原体检测， 一种能同时对上述多种病原体进行检测的方法也是提高检测通 量、 节约人力物力的必然需求。 [0003]现有技术中， 上述病原体的检测方法主要包括病毒 分离培养， 酶联 免疫检测及PC R 检测。 [0004]病毒培养分离技术用收集的样本与细胞共培养， 通过观察细胞病变或其他方法检 测病毒的扩增来确定样本中是否有病毒感染。 此方法虽然是曾经的病毒感染检测 “金标 准”， 但只能检测样本中的具有感染能力的病毒颗粒， 无法确定病原体种类， 后续仍需进行 PCR扩增或者测序， 并且病毒分离培养操作程序复杂， 对实验场地和设备有生物安全等级要 求， 检测耗时长， 不能用于现场检测， 更不能用于对大规模样品的常规 监测。 [0005]酶联免疫检测是基于抗体的酶标检测， 直接与间接荧光检测以及胶体金快速检测 均利用抗原与抗体之间的特异结合， 通过偶联显色基团的抗体实现对病原体的可视化检 测。 抗体检测不依赖大型设备， 而且检测结果可在30 分钟以内得到。 但抗体检测由于 没有信 号放大的过程， 灵敏度低， 而且结果容易出现假阳性及假阴性。 由于新抗体的制备周期较 长， 该方法很难用于新出现病毒的检测， 而且对于由抗原变异产生的新的病毒亚型 的检测 能力也值得怀疑。说　明　书 1/8 页 3 CN 114540552 A 3