(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210304396.3 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 昆明市农业科 学研究院 （昆明市农 业技术推广站昆明市农业 技术培训 服务中心昆明市土 壤肥料工作站） 地址 650034 云南省昆明市西山区环城西 路442号 (72)发明人 汪威　田霄　田云霞　任建青　 迟静娣　 (74)专利代理 机构 北京中政联科专利代理事务 所(普通合伙) 11489 专利代理师 陈超 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种金耳菌种纯度的检测方法及应用 (57)摘要 本申请公开了一种金耳菌种纯度的检测方 法， 其包括： 提取金耳菌种样品的DNA； 合成所述 DNA的特异性引物； 预实验； 制备标准品； 构建标 准曲线； 取所述DNA进行实时荧光定量PCR实验； 根据所述标准曲线和所述待测金耳菌种样品的 CT值计算待测金耳菌种样品的拷贝数， 从而定量 待测金耳菌种样品的纯度。 该方法简单高效、 结 果稳定、 重复性好、 特异性好、 所需检测时间短， 适合金耳菌种纯度和栽培过程的检测要求。 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 114836557 A 2022.08.02 CN 114836557 A 1.一种金 耳菌种纯度的检测方法， 其中， 包括以下步骤： 提取金耳菌种样品的DNA； 合成所述DNA的特异性引物； 取所述DNA、 所述特异性引物配置体系进行实时荧 光定量PCR 实验， 得到扩增目的产物； 回收所述扩增目的产物， 进行质粒 载体TA克隆， 克隆完成后提取质粒， 得到标准样品； 检测所述标准样品的浓度， 以梯度稀释所述标准样品， 得到若干个梯度样品， 将所述梯 度样品进行实时荧 光定量PCR 实验， 进行 数据分析并得到标准曲线； 取待测金耳菌种样品的DNA进行实时荧光定量PCR实验， 根据所述标准曲线和待测金耳 菌种样品的CT值计算待测金 耳菌种样品的拷贝数， 从而定量待测金 耳菌种样品的纯度。 2.根据权利要求1所述的金 耳菌种纯度的检测方法， 其中， 所述特异性引物包括： 特异性上游引物： 5' ‑AATCCAGTCGGAAACCCGAG‑3'， 和 特异性下游引物： 5' ‑ATCGATGA AGAACGCAGCGA ‑3’。 3.根据权利要求1所述的金耳菌种纯度的检测方法， 其中， 所述取所述DNA、 所述特异性 引物配置体系进行实时荧 光定量PCR 实验， 得到扩增目的产物包括： 取所述DNA、 所述特异性引物配置体系进行实时荧光定量PCR实验， 得到溶解曲线， 根据 溶解曲线判断产物是否单一、 所述特异性引物是否可用， 若产物并非单一、 引物不可用， 则 重复上述 步骤直至符合要求， 最终得到扩增目的产物。 4.根据权利要求1所述的金耳菌种纯度的检测方法， 其中， 所述回收所述扩增目的产 物， 进行质粒 载体TA克隆， 克隆完成后提取质粒， 得到标准样品包括： 回收所述扩增目的产物， 进行质粒载体TA克隆， 采用PCR筛选阳性克隆， 筛选出的克隆 进行测序确认， 克隆完成后提取质粒， 得到标准样品。 5.根据权利要求1所述的金耳菌种纯度的检测方法， 其中， 所述检测所述标准样品的浓 度， 以梯度稀释所述标准样品， 得到若干个梯度样品， 将所述梯度样品进行实时荧光定量 PCR实验， 进行 数据分析并得到标准曲线包括： 检测所述标准样品的浓度， 以10倍梯度稀释所述标准样品； 第一步、 将取10ul标准品加入到9 90ul水， 混匀稀释10 0倍， 作为第一个样品； 第二步、 从第一个样品中取10ul样品加入到90ul水， 混匀稀释10倍， 作为第二个样品； 第三步、 根据第一 步和第二 步， 以此类 推， 制备6 ‑8个梯度样品； 将所述梯度样品进行实时荧 光定量PCR 实验， 进行 数据分析并得到标准曲线。 6.根据权利要求5所述的金耳菌种纯度的检测方法， 其中， 每个所述梯度样品做3 ‑4复 孔。 7.根据权利要求1所述的金耳菌种纯度的检测方法， 其中， 取待测金耳菌种样品的DNA 进行实时荧 光定量PCR 实验时， 采用SYBR  Green I染料法进行qPCR绝对定量检测。 8.根据权利要求7所述的金耳菌种纯度的检测方法， 其中， 所述qPCR绝对定量检测的反 应体系包括： 2X T5 mix(syber  green)10μl； Prime ‑F(10μM)1μl； Prime ‑R(10μM)1μl； 灭菌水7μl； DNA模板(< 50ng)1 μl； 总体积20 μl。 9.根据权利要求1所述的金耳菌种纯度的检测方法， 其中， 通过扩增效率在90％ ‑ 110％， R2在0.99以上， 来判断所述标准曲线的质量。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114836557 A 210.根据权利要求1 ‑9中任一项所述的金耳菌种纯度的检测方法在金耳菌种制备和生 产全过程中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114836557 A 3