(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210306348.8 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 连云港市第二人民医院(连云港市 临床肿瘤研究所） 地址 222000 江苏省连云港市海州区幸福 路161号 (72)发明人 高绪柱　王方　王蕾　黄关宏　 (74)专利代理 机构 无锡苏元专利代理事务所 (普通合伙) 32471 专利代理师 张洪伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 用于肺炎链球菌RPA-LFS检测法的引物探针 组合及其应用 (57)摘要 本发明公采用RPA结合LFS技术， 建立了一种 快速、 灵敏的肺炎链球菌现场检测方法。 该方法 根据肺炎链球菌自溶素基因(lytA)设计引物探 针， 并且在37℃， 30min内完成检测。 通过对22株 肺炎链球菌的临床分离株及20株其它常见病原 菌进行检测， 验证了 该方法的特异性。 对RPA ‑LFS 方法的灵敏度进行了10次独立实验， 最低检测限 为3.32个集落形成单位(CFU)/反应。 最后， 对所 建立的肺炎链 球菌RPA‑LFS检测方法进行了临床 标本的检测， 与PCR方法相比， 检测结果准确一 致。 总之， 本研究开发了一种快速、 灵敏和特异的 肺炎链球菌RPA ‑LFS检测方法， 在偏远和资源有 限地区的初步医疗 诊断中有很好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114657272 A 2022.06.24 CN 114657272 A 1.用于肺炎链球菌RPA ‑LFS检测法的引物探针组合， 其特征在于， 引物探针组合为lyt ‑ 2‑F/mR/mP1， 其序列如下： lyt‑2‑F： GGATAAGGGTCAACGTGGTCTGAGTG GTTGTTTG； lytA‑2‑mR： Biotin‑GGATAAGGGTCAACGTGGTCTGAGTG GTTGGTTG； mP1： FITC‑AGTCTAGCAGATGA AGCAGGTTTGCCGAAA[THF]CGCTAGATACAG GGA‑/C3‑spacer/。 2.权利要求1所述的引物探针组合在肺炎链球菌RPA ‑LFS法检测中或检测试剂盒的制 备中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657272 A 2用于肺炎链球菌R PA‑LFS检测法的引物探针组合及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及肺炎链球菌的检测， 具体为用于肺炎链球菌RPA ‑LFS检测法的引物探 针组合及其应用。 背景技术 [0002]肺炎链球菌(S.Pneumoniae)是一种革兰染色阳性， 无鞭毛， 常为成对或短链状排 列的细菌， 其外面由多糖组成的荚膜 为致病的物质基础。 这种细菌在自然界中分布广泛， 常 定殖在人上呼吸道器官黏膜， 主要侵害的对象是免疫力低下的人群， 例如儿童和老年人， 感 染后会引起肺炎、 脑膜炎、 中耳炎等侵袭性疾病， 在 全球每年肺炎链球菌感染导致了 极高的 发病率与死亡率； 随着越来越多高耐药性肺炎链球菌临床分离株的出现， 肺炎链球菌感染 的防治变得越发困难。 而及时准确的病原学诊断， 对临床治疗药物的选择和治疗方案的制 定起到十分重要的作用。 [0003]在患者患病早期， 通过及时准确的诊断出病原体， 及早反映出临床感染， 有利于对 患者进行后续的正确治疗。 然而， 目前检测肺炎链球菌的金标准方法是基于表型的， 包括培 养、 显微镜检查和生化鉴定。 肺炎链球菌的生长和鉴定通常需要两天以上， 并且 该方法通常 具有检测时间长、 操作复杂以及容 易出现假阴性的缺 点。 [0004]目前阳性鉴定可能通常发生在感染过程的后期； 这种 延误的诊断可能会导致感染 该病原菌患者的预后不佳。 因此， 开 发和验证一种快速、 准确的肺炎链球菌鉴定方法势在必 行。 已经开发了几种用于检测肺炎链球菌的非培养方法， 包括质谱法、 免疫分析、 聚合酶链 式反应(PCR)、 实时PCR、 聚合酶螺旋反应(PSR)和环介导等温扩增(LAMP)； 与金标培养法相 比， 这些肺炎链球菌鉴定试验可以节省相当多的时间。 然而， 这样的分析反过来依赖于技术 人员或复杂的设备， 而这在某些情况 下可能是不可用的。 [0005]重组酶聚合酶等温扩增技术(Recomb inase Ploymerase  Amplication,RPA)是由 重组酶聚合酶介导的扩增， 模拟生物体内DNA复制， 在常温下即可对目标片段进行等温扩 增。 该技术主要依赖于三种酶： T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、 单链结合蛋白gp32 及Bsu DNA聚合酶。 其中， 重组酶蛋白可以与引物结合， 形成DNA核蛋白微丝， 微丝可以结合 匹配的DNA片段， 并紧密结合 发生重组， 在单链结合蛋白的帮助下,模板DNA开始解链,在Bsu   DNA聚合酶的作用下进 行复制延伸,对模板上的目标区域进 行指数式扩增。 整个过程仅需在 37‑42℃下反应20 ‑30分钟即可完成， 与PCR相比， 整个过程不需要高温变性和低温退火， 反 应简单、 快速高效。 将包被金纳米颗粒(AuNPs)的侧向流动带(LFS)与RPA结合起来对 标记的 扩增产物进行目视检测， 用肉 眼即可在LFS上半定量地观察彩色信号。 该技术进一步简化了 检测过程， 实现了无需仪器的现场检测。 发明内容 [0006]本发明采用RPA结合 LFS技术， 建立了一种快速、 灵敏的肺炎链球菌现场检测方法。 [0007]用于鉴定肺炎链球菌的分子靶点包括多种基因， 包括Spn9802片段(Ab deldaim,说　明　书 1/7 页 3 CN 114657272 A 3