(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210313336.8 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市友爱 北路51号 兽医所 (72)发明人 谢芝勋　张艳芳　曾婷婷　张民秀　 谢丽基　罗思思　黄娇玲　王盛　 邓显文　谢志勤　刘加波　 (74)专利代理 机构 北京卓岚智财知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11624 专利代理师 魏伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组、 探针及应用 (57)摘要 本发明提供微滴式数字PCR检测鸡细小病毒 的引物组、 探针及应用， 属于鸡细小病毒检测技 术领域， 物组由上游引物ChPV ‑F和下游引物 ChPV‑R和探针ChPV ‑P。 检测过程为参考GenBank 中ChPV的NS基因保守序列， 设计筛选了 特异性探 针和引物， 通过对反应条件的优化， 评估 特异性、 敏感性和重复性试验。 本发明对其他常见鸡病病 原体进行检测， 没有特异性扩增， 结果均为阴性， 批内重复性和批间重复性较好， 而对常见的鸡病 包括ANV、 CIAV、 AIV ‑H9、 NDV、 AGV2和IBV等进行检 测， 均没有出现特异性目的条带。 且灵 敏度4.5个 拷贝/反应， 高出荧光定量PCR和普通PCR10和 1000倍， 具有 超高的敏感性。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 114622039 A 2022.06.14 CN 114622039 A 1.微滴式数字PCR检测鸡细小病 毒的引物 组和探针， 其特征在于： 所述引物 组和探针的 核苷酸序列如下 所示： 上游引物C hPV‑F： 5’GAGGAACCCCCCTATACTG GTT 3’(SEQ ID NO： 1)； 下游引物C hPV‑R： 5’TCATTCTTACCTTCGTTGGCTTT 3’(SEQ ID NO： 2)； 探针ChPV‑P： 5’FAM‑TGAATCCGGGCTCTT‑BHQ1 3’(SEQ ID NO： 3)。 2.根据权利要求1所述的微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物组和探针， 其特征在 于： 所述上游引物C hPV‑F、 下游引物C hPV‑R和探针C hPV‑P的摩尔比为3:3:2。 3.根据权利要求1所述的微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物 组和探针在PCR扩增中 的应用， 其特 征在于： 退火温度为54.0℃。 4.根据权利要求1所述的微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物 组和探针在PCR扩增中 的应用， 其特征在于： 总的扩增体系为20 μL： dd  PCRTMSupermix  for Probe 10 μL， 设置6个 不同引物探针组合， 浓度均为600、 600、 900、 900、 1200、 1200nmol/L上下游引物各1μL， 对应 浓度梯度为20 0、 300、 400、 600、 700、 800nmol/L的探针1 μL 最后用ddH2O补足20 μL反应 体系。 5.根据权利要求4所述的微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物 组和探针在PCR扩增中 的应用， 其特征在于： dd  PCR反应程序为： 95℃预变性10min； 94℃30s， 退火温度60.0～ 50.0 ℃， 40个循环， 98℃固化10mi n， 4℃结束反应， 升降温度设置2.0℃/s。 6.根据权利要求5所述的微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物 组和探针在PCR扩增中 的应用， 其特征在于： Real ‑time PCR反应体系为20 μL： Probe  qPCR Mix， with UNG 10 μL， 上 游引物和下游引物各0.4μL， 浓度均为900nmol/L， 探针0.8μL， 浓度为900nmol/L， ROX   Reference  Dye 0.4 μL， 模板2 μL， d dH2O 6 μL。 7.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR检测鸡细小病毒的引物 组和探针在PCR扩增中 的应用， 其特征在于： 反应程序： 95℃预变性30s； 95℃5s， 退火温度60℃34s， 40个循环； 4℃ 结束反应。 8.鸡细小病毒微 滴式数字PCR检测方法， 其特 征在于： 所述方法包括如下步骤： 步骤1： 设计权利要求1的引物组和探针， 准备标准品制备参考文献引物ChPV ‑561F和 ChPV‑561R； 步骤2： DNA/RNA抽提及反转录， 参照DNA/RNA提取试剂盒说明书， 提取ChPV、 CIAV和A GV2 的DNA； 同时抽提ANV、 AIV ‑H9、 NDV和IBV的RNA， 使用反转录试剂按说明书将RNA反转录成 cDNA， 产物均保存于 ‑30℃冰箱备用； 步骤3： 制备质粒标准品， 将质粒标准品倍比稀释至107‑10‑3拷贝/ μL， 然后以其为模板， 分别进行d dPCR。 步骤4： 设计权利要求 4的反应体系； 步骤5： 特异性试验， 在已优化的ddPCR反应条件基础上， 对ChPV、 CIAV、 ANV、 AGV2、 AIV ‑ H9、 NDV和IBV待检DNA/cDNA样品进行检测， 同时检测阴性对照， 评估所建立的ddPCR方法的 特异性； 步骤6： 敏感性试验， 使用NanDrop  ND‑2000微量核酸检测仪对ChPV的标准品进行测定， 对已知浓度的质粒标准品倍比稀释至107‑10‑3拷贝/ μL， 然后以其为模板， 分别进行ddPCR、 Real‑time PCR和普通PCR， 评估灵敏性； 步骤7： 重复性试验， 在步骤4体系中加入相同的阳性模板， 分3个标本同时检测， 通过计权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114622039 A 2算变异系数CV来验证dd  PCR的批内重复性， 三天后重复检测保存于 ‑30℃的模板DNA， 来验 证ddPCR的批间重复性； 步骤8： 临床 样品检测试验， 对从采集的40份棉拭子样品， 进行检测， 试验重复两次。 9.根据权利要求8所述的鸡细小病 毒微滴式数字PCR检测方法， 其特征在于： 步骤3的具 体过程为， 将步骤1中的的DNA为模板进行PCR扩增， 反应体系为50μL， 含25μL  PCR Mix、 1μ mol/L引物ChPV ‑561F和1μmol/LChPV ‑561R、 19 μLddH2O、 4 μL DNA模板， 反应条件为： 95℃预 变性5min， 94℃60s， 55℃60s， 72℃60s， 35个循环， 72℃延伸10min， 得到561bp  PCR产物， 将 该PCR产物克隆至pMD ‑18T载体， 得到ChPV ‑561质粒； 测序ChPV ‑561质粒， 该质粒中含有的 PCR产物大小为561bp,测序结果经序列比对分析， 扩增的目的片段均与相应序列同源性高 达100％， 说明为阳性质粒， 含有鸡细小病毒保守序列。 10.根据权利要求8所述的鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法， 其特征在于： 步骤1中 的上游引物和下游引物各1μL， 最佳浓度为900nmol/L， 探针1μL， 最佳浓度为600nmol/L， 步 骤4中的反应 体系最佳 退火温度为54.0℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114622039 A 3