(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210312978.6 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 丁芳　霍妍妍　李晓婷　洪霓　 王国平　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种百合病毒LAV-1特异性检测靶序列、 试 剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种百合病毒LAV ‑1特异检测 靶序列、 试剂盒及检测方法， 所述靶序列的碱基 序列如SEQ  ID NO:1所示， 所述检测试剂盒包括 碱基序列如SEQID  NO:2和SEQ  ID NO:3所示的引 物对， 所述检测方法为： 将待测样品用改进的 Trizol法对RNA进行提取， 逆 转录得到cDNA， 使用 引物对进行PCR扩增进行凝胶电泳检测分析。 本 发明能够实现百合病毒LAV ‑1的快速、 特异性检 测， 为LAV‑1病毒的进一 步研究提供了技 术支持。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114703323 A 2022.07.05 CN 114703323 A 1.一种百合病毒LAV ‑1特异性检测靶序列， 其特征在于， 所述靶序列的碱基序列如SEQ   ID NO:1所示。 2.一种针对权利要求1所述靶序列的百合病毒LAV ‑1特异性检测试剂盒， 其特征在于， 包括碱基序列如SEQ  ID NO:2和SEQ  ID NO:3所示的引物对。 3.一种百合病毒LA V‑1的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 提取百合样品的总RNA； S2、 取总RNA通过逆转录酶合成cDNA； S3、 以cDNA为模板， 使用权利 要求2所述引物对进行PCR扩增， 产物进行琼脂糖凝胶电泳 检测。 4.根据权利 要求3所述百合病毒LAV ‑1的检测方法， 其特征在于， 步骤S1具体为： 将百合 叶片研磨后与Tr izol混匀， 离心取上清， 加入氯仿抽提； 离心取上清， 加入异丙醇混匀， 沉降 后离心弃 上清； 采用乙醇洗涤沉淀， 再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解， 即为样品总RNA。 5.根据权利 要求3所述百合病毒LAV ‑1的检测方法， 其特征在于， 步骤S2具体为： 取步骤 S1制备的总RNA， 加 入随机引物pd(N)6和DEPC水， 先沸水浴再迅速冷却后， 加 入反转录混合 液， 吸打混匀、 瞬离； 37℃水浴1～1.5 h后， 先沸水浴再迅速冷却， 瞬离即得。 6.根据权利要求5所述百合病毒LAV ‑1的检测方法， 其特征在于， 所述反转录混合液包 括： 4μL5×M‑MLV反应缓冲液、 1μL2.5mM  dNTPs、 0.5μL40U/μLRNA酶抑制剂、 0.5μL200U/μL   M‑MLV和4 μLDEPC水， 按总体积10 μL计。 7.根据权利要求3所述百合病毒LAV ‑1的检测方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR扩增的 体系为： 共15 μL， 7.5 μL  2×Taq Master Mix， 0.2 μM引物对， 1.0 μL  cDNA， ddH2O余量。 8.根据权利要求3所述百合病毒LAV ‑1的检测方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR扩增的 程序为： 95℃预变性5min； 95℃变性30s， 54℃退火， 72℃延伸20s， 30个循环； 72℃完全延伸 10min。 9.根据权利 要求3所述百合病毒LAV ‑1的检测方法， 其特征在于， 所述产物在1.2％琼脂 糖凝胶电泳上进行电泳检测， 其中阳性样品能扩增出 大小约650bp的目的片段。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703323 A 2一种百合病毒LAV ‑1特异性检测靶序列、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种百合病毒LAV ‑1特异检测靶序列、 试 剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]百合植物因其美丽的花色和花香而成为国际上受欢迎的观赏型花卉， 并培育出超 过4500个栽培品种。 但是百合经常感染病毒而导致百合叶片出现花叶， 黄化， 卷 曲变形， 严 重时甚至不开花， 严重影响了百合市场的经济发展。 已报道的侵染百合的病毒有20多种， 常 见病毒有黄瓜花叶病毒(CMV)、 百合斑驳病毒(LMoV)、 百合无症状病毒(LSV)、 百合病毒X (LVX)、 车前草花叶病毒(PlAMV)等等。 已报道的百合病毒大部分是通过指示植物法、 电镜观 察法和血清学技术等鉴定出来的， 但 通常受限于费时、 病毒 粒子提取困难等很难高效、 全面 的发现潜在的病 毒或新病 毒。 高通量技术(Hight ‑throughput  sequencing， HTS)可同时对 几十万到几百万个DNA分子进行序列鉴定， 使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全 貌的分析成为可能。 HTS 被广泛应用于新病毒的发现、 已知病原 鉴定及基因组遗传多样性和 进化的分析与比较， HTS在百合上的应用随着技 术的进步 也越来越广泛。 [0003]Amalgaviri dae科是最近发现的一种分类群， Amalgaviridae科包括Amalgavirus 和Zybavirus两个属， 其中Amalgavirus属报道了一些植物病毒， 例如蓝莓潜伏病毒、 杜鹃花 病毒A、 南方番茄病毒等。 这些植物病毒具有小的dsRNA基因组， 尚未显示形成真正的病毒 粒 子。 相反， 它们通过种子垂直传播， 被认为不太可能进行有效的细胞外传播， 除非可能通过 载体。 植物Amalgavirus属病毒的基因组正链包含两个部分重叠的长开放阅读框(ORF)， 下 游ORF2在+1框架中与ORF1重叠。 因此， 它们被认 为仅编码 两种蛋白质， 一种未知特定功能的 ORF1编码产物和ORF1+2编码的融合蛋白， 该蛋白在+1程序性核糖体移码(PRF)后被翻译。 该 融合蛋白的ORF2编码部分由保守序列基序指示 为病毒RNA 依赖性RNA聚合酶(RdRp)。 [0004]本发明通过了高通量测序 发现了一种百合新病毒Lily  amalgavirus  1(LAV‑1)， 并通过系统进化树和多重比对等方法， 认为该病毒可能是Amalgaviridae科Amalgavirus属 的新成员； 并且通过田间样 品检测结果来看， LAV ‑1的检出率较高。 但由于多为多种病毒复 合侵染， 由该病毒导致的症状尚未明确， 而 百合是鳞茎繁殖材料， 长期积累病毒对百合生长 产生的影响较大， 故建立快速诊断技 术对于后续研究和试验有较大的影响。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明的目的在于实现该百合病毒LAV1的快速、 特异以及低含量的检 测。 [0006]为了实现上述目的， 本发明的技 术方案具体如下： [0007]本发明第一方面提供了一个适合百合病毒LAV1特异性检测的靶序列， 该靶序列的 碱基序列如SEQ  ID NO:1所示。 [0008]本发明第二方面提供了一个针对上述靶序列的百合病毒LAV1特异性检测试剂盒，说　明　书 1/6 页 3 CN 114703323 A 3