(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210313271.7 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 中南大学 地址 410083 湖南省长 沙市岳麓区麓山 南 路932号 (72)发明人 夏赞贤　杜阿帅　李诗琴　 (74)专利代理 机构 长沙市融智专利事务所(普 通合伙) 43114 专利代理师 袁靖 (51)Int.Cl. C07H 21/02(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 环状RNAcirc MDK及其应用和肝癌治 疗制剂 (57)摘要 本发明公开了环状RNAcircMDK及其应用和 肝癌治疗制剂。 通过研究证实了circMDK是新的 环状RNA， 且在肝癌组织中高表达， 敲低circMDK (siRNA)能抑制肝癌细胞增殖、 迁移、 侵袭， 促进 凋亡。 采用单步纳米沉淀法制备了聚(β ‑氨基 酯)(PAEs)阳离子纳米 粒子， 并对siRNA进行了高 效包封。 PA E‑siRNA复合物通过siRNA沉 默来下调 circMDK的表达， 并有效抑制肝癌的发生和进展， 具有深远的临床意义 以及肝癌靶向治疗的应用 前景。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图9页 CN 114685587 A 2022.07.01 CN 114685587 A 1.一种环状RNAcirc MDK， 序列为： AGGGACAAGGCAGGGCATGATTGATTAAAGCTAACGAGCAGACAGAAGGCACTGGTGGGTCACATCTCGGGC CTGGGAGAGGGAGGGCGTGGGCCAGGCCCCAT。 2.检测circMDK表达量的试剂在制备肝癌诊断制剂中的应用， 所述的circMDK的序列 为： AGGGACAAGGCAGGGCATGATTGATTAAAGCTAACGAGCAGACAGAAGGCACTGGTGGGTCACATCTCGGGC CTGGGAGAGGGAGGGCGTGGGCCAGGCCCCAT。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 检测circMDK表达量的试剂包括： PCR检测 试剂， 或者原位杂交检测试剂； PCR检测试剂优选包 含扩增环状RNA  circMDK的引物： 上游引物： GC CTGGGAGAGGGAGGGCG 下游引物： C CGAGATGTGAC CCACCAGTGCC。 4.抑制circ MDK表达的试剂在制备肝癌治疗制剂中的应用， 所述的circ MDK的序列为： AGGGACAAGGCAGGGCATGATTGATTAAAGCTAACGAGCAGACAGAAGGCACTGGTGGGTCACATCTCGGGC CTGGGAGAGGGAGGGCGTGGGCCAGGCCCCAT。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 抑制circMDK表达的试剂包括抑制circMDK 表达的siRNA， 优选siRNA#1序列为GGGCCAGGCCCCATAGGGA、 siRNA#2序列为 CCAGGCCCCATAGGGACAA、 siRNA# 3序列为GC CCCATAGGGACAAGGCA； 进一 步优选siRNA#1序列。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 抑制circMDK表达的试剂包括： 采用聚(β ‑ 氨基酯)作为载体运载抑制circMDK表达的siRNA的PAE ‑siRNA复合物； 优选采用聚( β ‑氨基 酯)包裹抑制circ MDK表达的siRNA形成的复合物。 7.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述的肝癌治疗包括： 对肝癌细胞增殖、 迁 移和侵袭能力的抑制， 以及凋亡 水平的促进作用。 8.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述的PAE ‑siRNA复合物能提升肝癌肿瘤 细胞治疗的敏感性。 9.一种肝癌治疗药物， 其特征在于， 为抑制circMDK表达的试剂， 优选包括： 采用聚(β ‑ 氨基酯)作为载体运载抑制circMDK表达的siRNA的PAE ‑siRNA复合物； 优选采用聚( β ‑氨基 酯)包裹抑制circ MDK表达的siRNA形成的复合物。 10.根据权利要求9所述的肝癌治疗药物， 其特 征在于， 制备 方法包括以下步骤： (1)PAEs制备： 首先， 将1,4 ‑丁二醇二丙烯酸酯、 甘油三丙烯酸酯和5 ‑氨基‑1‑戊醇混 合， 在黑暗中加热剧烈搅拌， 以制备得到未封端的PAEs； 其次， 将端基丙烯酸酯聚(β ‑氨基 酯)在DMSO中溶解， 加入1,3 ‑二氨基丙烷溶液， 振荡培养； 随后， 将上述两种反应物混合， 氮 气保护； 最后， 得到的终产物经乙醚洗涤、 干燥； (2)PAE‑siRNA复合物制备： 将带正电荷的PAEs溶液与含有siRNA的溶液混合， 摇匀， 完 成siRNA与PAEs的静电作用结合。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114685587 A 2环状RNAcircMDK及其应用和肝癌治疗制剂 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤分子生物 学技术领域， 具体涉及环状RNAcircMDK、 检测circMDK表 达量的试剂在制备肝癌诊断制剂中的应用、 抑制circMDK表达的试剂在制备肝癌治疗制剂 中的应用、 以及新型纳米颗粒聚( β ‑氨基酯)运载circ MDK siRNA的肝癌治疗制剂。 背景技术 [0002]肝癌是全世界第六常见的癌症， 也是第二大癌症相关死亡原因。 这种疾病对健康 构成了严重的威胁， 给社会和个人带来了沉重的经济负担。 常见 的肝癌治疗手段有手术治 疗、 放疗、 化疗等， 然而， 常规治疗手段的副作用较大， 且对于放化疗耐受或者中晚期转移的 患者往往达不到好的效果。 因此， 开发肝癌新型治疗手段仍很有必要。 [0003]随着高通量测序技术和生物信息学的发展， 人们对非编码RNA(non ‑coding RNA, ncRNA)的研 究不断深入。 然而， 环状RNA在HCC(肝癌细胞)的发生发展以及药物靶向治疗中 的分子机制仍然不是十分清楚。 [0004]目前， 基因治疗已成为治疗癌症的一种新方法， 其中， RNA干扰便是一种调节靶基 因的方法。 然而， 裸siRNA的基因沉默效率非常低， 且容易被核酸酶快速降解， 因此， 开发安 全有效的递送系统是实现siRNA技术的关键。 聚( β ‑氨基酯)(PAEs)是一类重要的生物可降 解的合成聚合物， 可以被细胞内酯酶降解， 从而显著提高生物相容性。 由于其具有pH敏感 性、 高生物相容性和结构多样性等特点， 可灵活的合成和基因加载， 已成为基因和药物传递 载体和组织工程支架的主要研究对象。 由此可见， 聚( β ‑氨基酯)运载si RNA用于肝癌靶向治 疗有望作为一种新型肝癌治疗手段， 对提高放化疗耐受的中晚期以及转移患者的治疗疗效 有着重大的意 义。 [0005]已有研究表明， 通过纳米材料运载siRNA(包括lncRNA ‑siRNA和mRNA ‑siRNA)可以 在治疗过程中发挥抗肿瘤作用， 而借助纳米材料运载circRNA ‑siRNA在肿 瘤治疗过程中的 功能至今没有相关研究报道。 [0006]因此， 筛选出新型circMDK分子并利用聚( β ‑氨基酯)进行运载， 可以作为肝癌靶向 治疗的有效成分和新型策略， 若能尽早在专利领域得到很好的保护， 可以显著提高我国在 该技术领域的国际竞争力。 发明内容 [0007]本发明从肝癌组织RNA ‑Seq数据中筛选出了高表达的新的环状RNAcircMDK， 验证 了其在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况， 以及敲低circMDK后对肝癌细胞的增殖、 迁移、 侵袭和凋亡的影响； 进一步利用聚( β ‑氨基酯)运载circMDK的siRNA， 验证该纳米制剂复合 物在体内的抗肿瘤效果以及肝癌靶向治疗的应用前 景。 [0008]本发明首要目的是提供一种新的环状RNAcircMDK， 序列为AGGGACAAGGCAGGGCATG ATTGATTAAA GCTAACGA GCAGACAGAAGGCACTGGTGGGTCACATCTCGGGCCTGGGA GAGGGAGGGCGTGGGCC AGGCCCCAT， 见SEQ  NO.1。说　明　书 1/9 页 3 CN 114685587 A 3