(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210315311.1 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 郑州大学 地址 450000 河南省郑州市高新 技术开发 区科学大道100号 申请人 河南申友医学检验所有限公司 (72)发明人 郭建成　占闽宁　尚文俊　张静　 冯帅升　朱丹丹　孙晓晓　张悦　 史健翔　许红恩　刘海芳　薛夏　 王丙顺　柳丹华　秦亚平　薛滨雨　 (74)专利代理 机构 北京博识智 信专利代理事务 所(普通合伙) 16067 专利代理师 翁梅玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种HLA-DPA1基因全长扩增引物组、 分型试 剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种HLA ‑DPA1基因全长扩增 引物组、 分型试剂盒， 其上下游引物分别为HLA ‑ DPA1‑1F和HLA‑DPA1‑1R。 本发明可以有效提高扩 增效率和基因分型的准确率； 同时降低检测成 本， 简化操作步骤。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 114540486 A 2022.05.27 CN 114540486 A 1.一种HLA ‑DPA1基因全长扩增引物组， 其特征在于， 其上下游引物分别为HLA ‑DPA1‑1F 和HLA‑DPA1‑1R， 其具体序列为： HLA‑DPA1‑1F： 5’ ‑TTTCTGGATTGGAAGSTAGCCCTAC‑3’； HLA‑DPA1‑1R： 5’ ‑CGCTGGTACYTAAAATTCTCCCATC‑3’； 其中， 引物序列中S和Y为简并碱基， 分别代表G/C碱基和C/T碱基， 引物扩增长度 5515bp。 2.一种HLA ‑DPA1基因全长扩增引物组分型试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的 引物组。 3.一种基于HLA ‑DPA1基因全长扩增引物组的二代测序及分型方法， 其特征在于， 包括 如下步骤： S1.提取样本DNA 使用核酸提取试剂盒对样本进行核酸提取， 然后使用Nanodrop2000进行浓度及 纯度的 测定， DNA浓度应在40～200ng/ μL， OD260/280比值应在1.7～2.0之间， 然后将DNA浓度稀释至 40ng/ μL； S2.配置反应 体系及PCR扩增 配置HLA‑DPA1基因PCR扩增反应 体系， 然后在PCR仪器上进行PCR扩增； S3.HLA‑DPA1基因扩增产物纯化 S4.HLA‑DPA1基因纯化后产物打断 纯化后产物使用超声打断仪打断， 使DNA均匀片段化， 打断后产物使用Qubit  4.0进行 浓度测定， 使用Agilent  2100生物分析仪进行片段长度测定， 保证片段长度主要分布在150 ～300bp之间， 主峰在15 0‑250bp之间； S5.文库构建 对片段化后的DNA进行末端修饰、 接头连接和文库扩增反应， 扩增反应程序为： 98℃变 性45s； 98℃变性15s， 60℃退火30s， 72℃延伸30s， 进行6个循环； 72℃延伸1min； 4℃， ∞； 制 备完成的DNA文库使用Qubit  4.0进行浓度测定， 使用Agilent  2100生物分析仪进行片段长 度测定， 保证片段长度主 要分布在20 0～500bp之间， 主峰在3 00bp左右； S6.二代测序及数据分析 将质控合格的文库进行上机测序， 测序下机后的原始数据通过 fastp进行数据过滤， 将 过滤后的clean  data通过HLA ‑HD软件与IMGT/HLA数据库进行比对， 得到HLA ‑DPA1的基因分 型信息。 4.根据权利 要求3所述的一种基于HLA ‑DPA1基因全长扩增引物 组的二代测序及分型方 法， 其特征在于， S2步骤中的PCR扩增反应 体系为： 权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114540486 A 25.根据权利 要求3所述的一种基于HLA ‑DPA1基因全长扩增引物 组的二代测序及分型方 法， 其特征在于， S2步骤中的PCR扩增程序为： 权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114540486 A 3