(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210309511.6 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 地址 210046 江苏省南京市栖霞区红枫科 技园C1-2栋 申请人 南京诺唯赞动物保健有限公司 (72)发明人 张力军　赵敬发　时洁　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 ATP在LAMP中的新用途、 LAMP扩增体系和试 剂盒 (57)摘要 本发明涉及等温扩增技术领域， 公开了ATP 在LAMP中抑制非特异性扩增的应用， 为ATP在生 物技术领域的应用提供了新方向。 本发明还公开 了一种LAMP 扩增体系， 在其中添加了适量的ATP， 能够显著抑制扩增过程中的非特异扩增； 同时， 还能缩短反应时间， 节约试验成本， 提高反应灵 敏度和准确性。 本发明还公开了用上述核酸扩增 体系进行核酸检测的试剂盒， 检测时受非靶序列 的影响小、 灵敏度高、 准确性好； 检测周期短， 在 1h内即可快速检测靶标； 此试剂盒适合中小型单 位和现场检测应用。 权利要求书2页 说明书12页 序列表2页 附图1页 CN 114836522 A 2022.08.02 CN 114836522 A 1.ATP在LAMP中抑制非特异性扩增的应用。 2.根据权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述ATP的浓度为0.1～3mmol/L， 优选1.5～ 2.5mmol/L。 3.根据权利要求1所述应用， 其特 征在于， 扩增模板为DNA模板， 优选为 λDNA或GP13 0。 4.一种LAMP扩增体系， 其特征在于： 所述体系包括： ATP、 核酸模板、 引物、 核酸聚合酶、 缓冲液、 dNTPs、 硫酸镁。 5.根据权利要求4所述的扩增体系， 其特征在于： 所述体系还包括解旋酶， 所述解旋酶 选自UvrD酶。 6.根据权利要求 4所述的扩增体系， 其特 征在于： 所述核酸模板为DNA模板 。 7.根据权利要求6所述的扩增体系， 其特征在于： 所述核酸模板为λDNA， 所述引物包括 上游内引物、 下游内引物、 上游外引物、 下游外引物、 环引物； 所述上游内引物的序列如SEQ   NO.1所示， 所述下游内引物的序列如SEQ  NO.2所示； 所述上游外引物的序列如SEQ  NO.3所 示， 所述下游外引物的序列如SEQ  NO.4所示； 所述环引物的序列如SEQ  NO.5所示。 8.根据权利 要求6所述的扩增体系， 其特征在于： 所述核酸模板为GP130， 所述引物包括 上游内引物、 下游内引物、 上游外引物、 下游外引物、 环引物； 所述上游内引物的序列如SEQ   NO.6所示， 所述下游内引物的序列如SEQ  NO.7所示； 所述上游外引物的序列如SEQ  NO.8所 示， 所述下游外引物的序列如SEQ  NO.9所示； 所述环引物的序列如SEQ  NO.10所示。 9.根据权利要求6所述的扩增体系， 其特征在于： 所述核酸聚合酶为DNA聚合酶或其功 能活性片段， 优选为Bst  DNA聚合酶 或其功能活性片段。 10.根据权利要求6所述的扩增体系， 其特征在于： 所述ATP  0.1～3mmol/L， 所述引物包 括： 上游内引物0.5～2.5 μmol/L、 下游内引物0.5～2.5 μmol/L、 上游外引物0.05～ 0.4 μmol/ L、 下游内引物0.05～ 0.4 μmol/L、 环引物0.4～1.2 μmol/L； 所述核 酸聚合酶4～10U/ μL， 所述 硫酸镁3.9～11mmol/L， 所述DNA模板4～4x106copies/ μl； 所述缓冲液的pH为7.5～9.4， 包 括： Tris‑HCl 10～40mmol/L， KCl  4～20mmol/L， (NH4)2SO44～20mmol/L， MgSO40.1～5mmol/ L， Triton  X‑1000.01w/w％～1w/w％； 所述dNTPs包括： dATP  0.1～3mmol/L， dGTP  0.1～ 3mmol/L， dCTP 0.1～3mmol/L， dTTP 0.1～3mmol/L。 11.根据权利要求6所述的扩增体系， 其特征在于： 所述ATP1.5～2.5mmol/L， 所述引物 包括： 上游内引物1.0～2.0μmol/L， 下游内引物1.0～2.0μmol/L， 上游外引物0.1～0.3μ mol/L， 下游内引物0.1～0.3 μmol/L， 环引物0.6～1.0 μmol/L； 所述核酸聚合酶5～9U/ μL， 所 述硫酸镁 5～10mmol/L， 所述DNA模 板4x101～4x105copies/ μl； 所述缓冲液的pH为8.0～9.0， 包括： Tris ‑HCl 15～30mmol/L， KCl  7～15mmol/L， (NH4)2SO47～15mmol/L， MgSO41～3mmol/ L， Triton  X‑1000.05w/w％～0.5w/w％； 所述dNTPs包括： dATP  0.5～2mmol/L， dGTP  0.5～ 2mmol/L， dCTP 0.5～2mmol/L， dTTP 0.5～2mmol/L。 12.根据权利要求6所述的扩增体系， 其特征在于： 所述ATP  1.6mmol/L， 所述引物包括： 上游内引物1.6μmol/L， 下游内引物1.6μmol/L， 上游外引物0.2μmol/L， 下游内引物0.2μ mol/L， 环引物0.8μmol/L； 所述核酸聚合酶6～8U/μL， 所述硫酸镁6mmol/L， 所述DNA模板 4x102～4x104copies/ μl； 所述缓冲液的pH为8.8， 包括： Tris ‑HCl 20mmol/L， KCl  10mmol/L， (NH4)2SO410 mmol/L， MgSO42mmol/L， Triton  X‑1000.1w/w％； 所述dNTPs包括： dATP  1～ 1.4mmol/L， dGTP1～1.4m mol/L， dCTP 1～1.4mmol/L， dTTP 1～1.4mmol/L。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114836522 A 213.一种LAMP扩增试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求 4～12任一所述的扩增体系。 14.一种利用权利要求13所述试剂盒进行LAMP扩增检测的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 1)将ATP、 引物、 核酸聚合酶、 缓冲液、 dNTPs、 硫酸镁、 核酸模板在反应管中混合， 加入荧 光染料， 得到混合液； 2)将混合液恒温扩增反应， 进行检测。 15.根据权利要求14所述的方法， 其特征在于： 所述恒温扩增反应的温度 范围为30～75 ℃， 优选50～70℃， 更优选 60～65℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114836522 A 3