(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210310177.6 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 仁景 （苏州） 生物科技有限公司 地址 215000 江苏省苏州市中国 （江苏） 自 由贸易试验区苏州片区苏州工业园区 桑田街218号苏州生物医药产业园二 期乐橙广场5楼E489单 元 (72)发明人 王静　岑山　董翊洁　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 何叶喧 (51)Int.Cl. C12N 15/63(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表 达载体及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种IRES序列介导的非帽依 赖型的基因表达载体及其应用， 具体的， 所述应 用为体外转录RNA的翻译表达。 本发明提供了DNA 分子甲， 自上游至下游依次包括如下元件： 5 ’ UTR、 供目的基因插入 的位点和3 ’UTR。 本发明还 保护具有所述DNA分子甲的重组载体甲。 本发明 还提供了DNA分子乙， 自上游至下游依次包括如 下元件： 5 ’UTR、 目的基因和3 ’UTR。 本发明还保护 具有所述DNA分子乙的重组载体乙。 5 ’UTR如序列 表的序列1中第442 ‑1183位所示。 本发明提供了 重组载体可用于体外转录mRNA， 尤其适用于mRNA 疫苗或mRNA药物的制备。 本发明对于mRNA疫 苗或 mRNA药物生产具有重大的应用推广价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表7页 附图1页 CN 114540387 A 2022.05.27 CN 114540387 A 1.DNA分子， 自上游至下游依次包括如下元件： 5 ’UTR、 供目的基因插入的位点和3 ’UTR； 所述5’UTR如序列表的序列1中第4 42‑1183位所示。 2.具有权利要求1所述DNA分子的重组载体。 3.一种制备mRNA的方法， 包括如下步骤： (1)将目的基因插入权利要求2所述重组载体中的所述供目的基因插入的位点， 得到重 组质粒； (2)将权利要求(1)所述重组质粒进行线性 化， 然后进行体外转录， 得到mRNA。 4.DNA分子， 自上游至下游依次包括如下元件： 5 ’UTR、 目的基因和3 ’UTR； 所述5 ’UTR如 序列表的序列1中第4 42‑1183位所示。 5.具有权利要求 4所述DNA分子的重组载体。 6.一种制备mRNA的方法， 包括如下步骤： 将权利要求5所述重组质粒进行线性化， 然后 进行体外转录， 得到mRNA。 7.权利要求3或6所述方法制备 得到的mRNA。 8.权利要求1或4所述DNA分子或权利要求2或5所述重组载体在制备mRNA中的应用。 9.一种mRNA， 是权利要求1或4所述DNA分子转录得到的。 10.一种mRNA， 是权利要求2或5所述重组载体转录得到的。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540387 A 2一种IRES序列介导 的非帽依赖型的基因表达载体及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体 及其应用， 具体的， 所述应用为体外转录RNA的翻译表达 。 背景技术 [0002]20世纪60年代mRNA首次被科研人员发现， 随着mRNA合成、 修饰技术和 递送技术的 发展， 现在mRNA作为药物已逐渐被应用到疫苗及 疾病治疗等多种领域。 简单来讲， mRNA药物 是指经过体外转录合成及修饰的mRNA， 被递送至细胞或体内， 进而表达病毒抗原以激活机 体的免疫能力， 或产生机体所需要的目的蛋白， 达 到传染病预防、 肿瘤治疗等目的。 [0003]相比传统手段， mRNA 具有生产方便、 半衰期短、 无整合风险、 安全性高等优势。 mRNA 不需要入核， 进入细胞质即启动蛋白质翻译 过程。 mRNA 不需要整合到基因组， 只是瞬时表达 编码蛋白， 因此不存在插入突变的风险。 而且， mRNA在细胞内是暂时性的活跃， 可以通过生 理途径完全代谢， 没有持续积累毒性的风险。 此外， mRNA的快速、 简易制备方法和低成本也 是其成为非常有潜力的候选药物的优势之一。 [0004]mRNA的稳定翻译需要5 ’的帽子结构。 真核生物mRNA由7 ‑甲基鸟嘌呤三磷酸核苷 (m7GpppN)组成帽子结构。 mRNA的加帽过程是mRNA生产中举足轻重的步骤之一。 在常规mRNA 体外转录制备方案中， 常用的加帽方法主要有两种， 一种 是使用牛痘病毒加帽酶进行转录 后加帽， 但该方法制备和纯化步骤繁琐， 成本较高。 另一种是使用抗反转帽结构类似物 (ARCA,Anti ‑reverse cap analogues)进行共转录加帽， 该方法加帽效率较低， 无法完全满 足目前mRNA制备及生产的实际需求。 近期， 科学家开发了CleanCap加帽技术， 加帽效率可达 90％， 但仍然需要考虑成本。 因此， 开发更优的mRNA体外转录替代方案， 对于mRNA药物的研 发及应用前 景具有十分重要的意 义。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种IRES序列介导的非帽依赖型的基因表达载体及其应用， 具体的， 所述应用为体外转录RNA的翻译表达 。 [0006]本发明提供了一种DNA分子(DNA分子甲)， 自上游至下游依次包括如下元件： 5 ’ UTR、 供目的基因插入的位点和3 ’UTR； 所述5 ’UTR如序列表的序列1中第442 ‑1183位所示。 该 5’UTR即EV71 ‑IRES(EV71病毒的IRES)。 [0007]所述3’UTR为人β‑globin的3’UTR。 [0008]所述3’UTR为两个连续的人β ‑globin的3’UTR。 [0009]所述3’UTR如序列表的序列1中第2857 ‑3070位所示。 [0010]所述DNA分子中还包括启动子和polyA， 所述启动子位于5 ’UTR的上游， 所述polyA 位于3’UTR的下游。 [0011]所述启动子为T7启动子 。 [0012]所述启动子如序列表的序列1中第42 2‑441位所示。说　明　书 1/6 页 3 CN 114540387 A 3