(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210314762.3 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市友爱 北路51号 (72)发明人 吴健敏　刘金凤　覃绍敏　宋瑞鹏　 马玲　陈凤莲　林俊　秦树英　 韦珏　许力士　韦珊珊　杨磊　 (74)专利代理 机构 广西中知科创知识产权代理 有限公司 4513 0 专利代理师 牙斐颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 RAA荧光法检测FPV的引物探 针组及试剂盒 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 特别涉及RAA荧 光法检测FPV的引物探针组及试剂盒， 本发明的 引物探针组经过简并设计后， 能检测出更多的 FPV基因型， 经过与其它引物探针组进行对比发 现该引物探针组具有灵敏性高、 检测效果更好的 特点， 同时， 本发明还制备了相应的RAA试剂盒 并 建立相应的RAA 检测方法， 经过试验表明， 该试剂 盒能在恒温条件下(3 7‑42℃)进行， 5 ‑30min内即 可实现对猫细小病毒的快速、 定性检测， 具有操 作便捷、 特异性强、 灵敏度高、 重复性好的特点， 完全能满足猫细小病毒快速诊断， 适合临床快速 检测， 具有广泛的应用前 景。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114457197 A 2022.05.10 CN 114457197 A 1.RAA荧光法检测FPV的引物探针组， 包括上游引物、 下游引物和探针， 其特征在于， 所 述上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所 示； 所述探针为在SEQ  ID NO.3所示核苷酸序列的第34位碱基修饰荧光报告基团， 在第36位 碱基修饰四氢呋喃残基和在第37位碱基修饰淬灭基团。 2.根据如权利要求1所述的引物探针组， 其特征在于， 所述荧光报告基团为FAM的胸腺 嘧啶脱氧核苷酸、 所述淬灭基团为BHQ的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。 3.包括如权利要求1或2任意 一项所述引物探针组的试剂盒。 4.如权利要求3所述试剂盒在检测FPV上的应用。 5.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中上游引物、 下游引物和探针 的摩尔比为10:10:3 。 6.非诊断目的用于FPV的检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： 收集病猫的肛拭子或病死猫的组织样品， 提取样品DNA， 将该产物与引物探针组混合进 行RAA反应， 反应呈 阳性说明样品中有FPV； 反应呈 阴性说明样品中无 FPV。 7.根据权利 要求6所述非诊断目的用于FPV的检测方法， 其特征在于， 所述RAA反应的反 应体系为： A  Buffer 25 μL、 10 μmol/L的上游引物2 μL、 10 μmol/L的下游引物2 μ、 10 μmol/L的 探针0.6μL； DNA模板2μL； 补足dd  H2O至47.5μL， 混合均匀后短暂离心， 再加入2.5μL  B  Buffer混合均匀即得。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457197 A 2RAA荧光法检测FPV的引物探针组及 试剂盒 【技术领域】 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 特别涉及RA A荧光法检测FPV的引物探针组及试剂盒。 【背景技术】 [0002]猫瘟热又名猫泛白细胞减少症、 猫传染性肠炎等， 是由猫细小病毒(FPV)引起的猫 的一种急性、 高度接触性和致死性传染性传染病。 临床上以突发高热、 呕吐、 腹泻及白细胞 严重减少为主要特征， 是家猫最常见的传染病。 FPV可通过直接或间接接触感染， 发病动物 通过粪、 尿、 呕吐物、 唾液等排泻物和分泌物排毒， 污染环 境、 器具、 饲料等， 引起直接和间接 传染， 常呈地方性流行， 其病死率一般为60％～70％， 最高可达90％以上(幼兽死亡率可达 100％)。 FPV常与其他病毒混合感染， 也常引起细菌的继发感染， 严重威胁着猫科动物的健 康， 给疫病的防控带来极大的困难。 快速、 准确的进行猫细小病毒的诊断具重要现实意 义。 [0003]我国不同疫病的检测技术的研发已经比较完善， 主要包括病原学检测技术、 免疫 学检测技术和分子生物学检测技术。 各种检测技术在特异性、 灵敏性、 稳定性、 重复性等方 面都显示了各自不同的优势。 分子生物学检测 技术因其敏感性、 特异性在动物病原检测中 具有良好的应用前景。 猫细 小病毒的分子生物学检测技术主要包括普通P CR、 实时荧光定量 PCR(Q‑PCR)及近年发展较快的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。 PCR和Q ‑PCR技术重复性 好、 灵敏度高、 特异 性强、 检出率高， 但操作复杂、 对人员和设备有较高的要求， 检测时间长； LAMP技术是一种较新的基因诊断技术， 其原理是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引 物， 运用具有链置换 活性的DNA聚合 酶在65℃恒温条件 下通过自动循环的链置换DNA 合成过 程， 反应约60min， 可实现对靶DNA的扩增， 但 技术存在假阳性高， 引物探针 设计复杂， 不容易 设计等问题。 重组酶介导扩增(RAA)技术是一种在恒温条件下进 行核酸快速扩增的方法， 使 用RAA技术可在短时间内获得琼脂糖凝胶电泳检测可见的扩增片段， 并且在RAA反应体系中 加入荧光基团， 利用与荧光信号 实时监控整个RAA反应过程， 半个小时以内可实现对起始模 板的定量和定性分析。 整个反应过程快速简单， 因为不需要高温循环， 不需要昂贵的仪器设 备， 特别适用于非 实验室检测场所。 【发明内容】 [0004]鉴于上述内容， 有必要提供快速检测FPV的引物、 探针、 试剂盒和方法， 该方法能利 用该试剂盒实现对FPV的快速检测。 [0005]为达到上述目的， 本发明所采用的技 术方案是： [0006]RAA荧光法检测FPV的引物探针组， 包括上游引物、 下游引物和探针， 所述上游引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述探针 为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第34位碱基修饰荧光报告基团， 在第36位碱基修饰四 氢呋喃残基和在第37位碱基修饰淬灭基团。 [0007]进一步的， 所述荧光报告基团为FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸、 所述淬灭基团为BHQ 的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。说　明　书 1/5 页 3 CN 114457197 A 3