(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210313375.8 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 浙江省农业科 学院 地址 310021 浙江省杭州市石桥路198号 (72)发明人 沈钰森　王建升　顾宏辉　虞慧芳　 盛小光　赵振卿　 (74)专利代理 机构 成都知棋知识产权代理事务 所(普通合伙) 51325 专利代理师 马超前 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量 相关的SNP标记及引物和应用 (57)摘要 本发明公开了一种 与西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁 烯基芥子油苷含量相关的SNP标记及引物和应 用， 该SNP标记位于拟南芥GSL ‑OH基因在西兰花 中的同源基因BolC3t13531H 的第3个外显子中， 在西兰花HDEM参考基因组C3染色体第509 6634位 置的碱基G或C， 当碱基序列由G突变为C时， 对应 合成的氨基酸由甘氨酸变为精氨酸， 使得2 ‑羟 基‑3‑丁烯基芥子油苷含量显著提高。 本发明针 对西兰花GSL‑OH位点开发KASP分子 标记， 通过关 联分析， 获得了与2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷紧 密连锁的KASP标记， 并将该标记成功 应用于西 兰 花芥子油苷育种中。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114836559 A 2022.08.02 CN 114836559 A 1.与西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记， 其特征在于， 该SNP标记 位于西兰花基因BolC3t13531H的第3个外显子中， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示， 其具 有G/C多态性。 2.与西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记引物， 其特征在于， 该SNP 标记引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示。 3.根据权利要求2所述的SNP标记引物， 其特征在于， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑2所示 的引物的5'端分别增 加通用接 头序列。 4.根据权利要求3所述的SNP标记引物， 其特征在于， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的 引物的5'端增加核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的通用接头序列； 核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2所示的引物的5'端增 加核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的通用接 头序列。 5.如权利要求2 ‑4中任意一项所述的SNP标记引物的应用， 其特征在于， 该应用选自以 下任意一种： (1)在西兰花分子标记辅助育种方面的应用； (2)在西兰花改良育种中的应用； (3)在西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥 子油苷含量 性状鉴定中的应用； (4)在研究西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥 子油苷含量方面的应用。 6.一种筛选高2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量西兰花的方法， 其特征在于， 该方法包 含： 采用如权利要求2 ‑4中任意一项所述的SNP标记引物对待检测西兰花通过KASP技术进 行基因分型： 基因分型为GG的西兰花的2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量<基因分型为CG的西 兰花的2‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量<基因分型为CC的西兰花的2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油 苷含量。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述KASP技术， 以待检测西兰花的基因组 DNA为DNA模板， 与如权利要求2 ‑4中任意一项所述的SNP标记引物和KASP  Master mix进行 PCR扩增。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述KASP  Master mix包含： FRET   cassette荧光引物、 ROX内参染料、 Klear  Taq DNA聚合酶、 dNTP和MgCl2。 9.含有如权利要求2 ‑4中任意一项所述的SNP标记引物的KAS P分型检测试剂盒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836559 A 2与西兰花 中2‑羟基‑3‑丁烯基芥 子油苷含量相关的SNP标记及 引物和应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种S NP标记， 具体涉及一种与西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含 量相关的SNP标记及引物和应用。 背景技术 [0002]西兰花(Brassica  oleracea  L.var.italica)中一些芥子油苷降解产生的异硫代 腈酸盐具有人体有益的生物活性， 特别是萝卜硫苷降解产生的异硫代腈酸盐即萝卜硫素， 它不仅可以降低多种癌症的发生， 如结肠癌、 胰腺癌、 膀胱癌等， 还可以降低心血管疾病的 发生。 [0003]十字花科植物中芥子油苷的组成主要受到基因型决定。 芥菜、 白菜、 甘蓝、 榨菜、 萝 卜和油菜中主要以烯基化的2 ‑丙烯基芥子油苷、 3 ‑丁烯基芥子油苷和2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥 子油苷为主， 与萝卜硫素相比， 这些修饰后的芥子油苷代谢产生的异硫代腈酸盐抗癌活性 有限。 特别是2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷水解产物唑烷 ‑2‑硫酮对人体和一些哺乳动物有 害， 主要是引起甲状腺肿大， 因此在油菜育种中低硫苷育种成为必须育种目标。 研究表明， 植物体内萝卜硫苷在GSL ‑ALK的作用下合成3 ‑丁烯基芥子油苷， 然后经GSL ‑OH羟化酶催化 产生2‑羟基‑3‑丁烯基芥 子油苷。 [0004]基于芥子油苷及其代谢产物的营养功能， 国内外科学家开展了西兰花芥子油苷育 种， 其主要目标是提高西兰花中萝卜硫苷含量， 降低或消除2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷。 然 而， 大量研究发现， 西兰花部分种质资源以及某些栽培种中含有负营养芥子油苷组分2 ‑羟 基‑3‑丁烯基芥 子油苷。 [0005]目前， 西兰花中芥子油苷的检测主要采用液相检测法， 步骤较繁琐， 检测时间长， 极其不利于大规模种质筛 选和育种。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供一种与西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量相关的SNP 标记及引物和应用， 解决了传统液相检测法西兰花中芥子油苷检测时间长的问题， 通过 KASP技术快速对西兰花进行检测， 能够成功应用于西兰花高芥 子油苷育种中。 [0007]为了达到上述目的， 本发明提供了与西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量相 关的SNP标记， 该SNP标记位于西 兰花基因BolC3t13531H的第3个外显子中， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示， A GTACAGGGAAACCACTCCGGAAGCCTCCAACCACTATGTGGCTA GAAAAGGTGATGGGA ACAATTCGTTGAGCCATTTAAGGATCTGAACAAAATTGGTG， 其具有G/ C多态性(序列中第51位)。 [0008]本发明的另一目的是提供与西兰花中2 ‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量相关的SNP 标记引物， 该SNP标记引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示。 [0009]优选地， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑2所示的引物的5'端分别增 加通用接 头序列。 [0010]优选地， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的引物的5'端增加核苷酸序列如SEQ  ID 说　明　书 1/5 页 3 CN 114836559 A 3