(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210313315.6 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市友爱 北路51号 兽医所 (72)发明人 谢芝勋　张艳芳　曾婷婷　张民秀　 谢丽基　罗思思　黄娇玲　王盛　 邓显文　谢志勤　刘加波　 (74)专利代理 机构 北京卓岚智财知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11624 专利代理师 魏伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物 组、 探针及应用 (57)摘要 本发明提供微滴式数字PCR检测禽圆环病毒 2型的引物组、 探针及应用， 属于禽圆环病毒2型 检测技术领域， 所述引物组包括上游引物AGV2 ‑F 和下游引物AGV2 ‑R， 探针为AGV2 ‑P， 检测过程为 参考GenBank中AGV2的VP基因保守序列， 设计筛 选了特异性探针和引物， 通过对反应条件的优 化， 评估特异性、 敏感性和重复性试验。 本发明对 其他常见鸡病病原体进行检测， 均为阴性， 且灵 敏度达到了3.2个拷贝/反应， 是荧光PCR和普通 PCR的10倍和100倍， 具有很高的敏感性， 满足病 毒快速检测的要求。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 114622038 A 2022.06.14 CN 114622038 A 1.微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针， 其特征在于： 所述引物组和探 针的核苷酸序列如下 所示： 上游引物 AGV2‑F： 5’GACGATGGAGGAGTCACTG GTT 3’(SEQ ID NO： 1)； 下游引物 AGV2‑R： 5’GTCCGTCTGGGTYTCCTGTGT 3’(SEQ ID NO： 2)； 探针AGV2‑P： 5’FAM‑CAGGAGGCTAGTGGACT‑BHQ1 3’(SEQ ID NO： 3)。 2.根据权利要求1所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针， 其特征 在于： 所述上游引物 AGV2‑F、 下游引物 AGV2‑R和探针AGV 2‑P的摩尔比为9:9:5 。 3.根据权利要求1所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩 增中的应用， 其特 征在于： 退火温度为54.0℃。 4.微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩增中的应用， 其特征在 于： 总的扩增体系为20μL： dd  PCRTMSupermix  for Probe 10μL， 设置6个不同引物探针组 合， 浓度为600、 600、 900、 900、 1200、 1200nmol/L上下游引物各1μL， 对应浓度梯度为150、 300、 250、 500、 350、 600nmol/L的探针1 μL， 模板2 μL， 最后用d dH2O补足20 μL反应 体系。 5.根据权利要求4所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩 增中的应用， 其特征在于： dd  PCR反应程序为： 95℃预变性10min； 94℃30s， 退火温度60.0～ 50.0℃， 40个 循环， 98℃固化10mi n， 4℃结束反应， 升降温度设置2.0℃/s。 6.根据权利要求5所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩 增中的应用， 其特征在于： Real ‑time PCR反应体系为2 0 μL： Probe  qPCR Mix， with UNG 10 μ L， 上下游引物各0.4μL， 浓度为900nmol/L， 探针0.8 μL， 浓度为900nmol/L， ROX  Reference   Dye 0.4 μL， 模板2 μL， d dH2O 6 μL。 7.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的引物组和探针在PCR扩 增中的应用， 其特征在于： 反应程序： 95℃预变性30s； 95℃5s， 退火温度60℃34s， 40个循环； 4℃结束反应。 8.微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的方法， 其特 征在于： 所述方法包括如下步骤： 步骤1： 设计权利要求1的引物组和探针， 准备标准品制备参考文献引物AGV2 ‑376F和 AGV2‑376R； 步骤2： DNA/RNA抽提及反转录， 参照DNA/RNA提取试剂盒说明书， 提取AGV2、 CIAV和ChPV 的DNA， 同时抽提ANV、 AIV ‑H9、 NDV和IBV的RNA， 使用反转录试剂按说明书将RNA反转录成 cDNA， 产物均保存于 ‑30℃冰箱备用； 步骤3： 制备质粒标准品， 将质粒标准品倍比稀释至107‑10‑3拷贝/ μL， 然后以其为模板， 分别进行d dPCR。 步骤4： 设计权利要求 4的反应体系； 步骤5： 特异性试验， 在已优化的ddPCR反应条件基础上， 对AGV2、 CIAV、 ANV、 ChPV、 AIV ‑ H9、 NDV和IBV待检DNA/ cDNA样品进行检测， 同时检测阴性对照， 评估特异性； 步骤6： 敏感性试验， 使用NanDrop  ND‑2000微量核酸检测仪对AGV2的标准品进行测定， 对已知浓度的质粒标准品倍比稀释至107‑10‑3拷贝/ μL， 然后以其为模板， 分别进行ddPCR、 Real‑time PCR和普通PCR， 评估灵敏性； 步骤7： 重复性试验， 在步骤4中的体系中加入相同的阳性模板， 分3个标本同时检测， 通 过计算变异系数CV来验证 dd PCR的批内重复性， 三天后重复检测保存于 ‑30℃的模板DNA，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114622038 A 2来验证dd PCR的批间重复性。 9.根据权利要求8所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的方法， 其特征在于： 步骤 3的具体过程为， 将步骤1中的DNA为模板进行PCR扩增， 反应体系为50 μL， 含2 5 μL PCR Mix、 1 μmol/L引物AGV2 ‑376F和AGV2 ‑376R、 19μLddH2O、 4μL DNA模板， 反应条件为： 95℃预变性 5min， 94℃60s， 55℃60s， 72℃60s， 35个循环， 72℃ 延伸10min， 得到3 76bp PCR产物， 将该PCR 产物克隆至pMD ‑18T载体， 得到AGV2 ‑376质粒， 测序AGV2 ‑376质粒， 该质粒中含有的PCR产物 大小为376b p， 测序结果经序列比对分析， 扩增的目的片段均与相应序列同源性高达100％， 说明为阳性质粒， 含有禽圆圈病毒2型保守序列。 10.根据权利要求8所述的微滴式数字PCR检测禽圆环病毒2型的方法， 其特征在于： 步 骤1中的最佳探针浓度为500nmol/L， 最佳上下游浓度均为900nmol/L， 步骤4中的反应体系 最佳退火温度为54.0℃。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114622038 A 3