(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210318148.4 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市友爱 北路51号广西兽医研究所 (72)发明人 谢芝勋　谢志勤　张艳芳　范晴　 谢丽基　万丽军　罗思思　李孟　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 关畅 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 检测鸡传染性喉气管炎病毒的组合物及其 应用 (57)摘要 本发明检测鸡传染性喉气管炎病毒的组合 物及其应用， 属于微生物的测定或检验方法其所 用的组合物 技术领域。 本发明公开了试剂或试剂 盒在检测或辅助检测鸡传染性喉气管炎病毒中 的应用， 所述试剂或试剂盒包括鸡传染性喉气管 炎病毒引物探针， 所述鸡传染性喉气管炎病毒引 物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ  ID  No.1的DNA片段在内的鸡传染性喉气管炎病毒基 因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ  ID  No.1的DNA片段特异结合的探针组成。 通过比较 不同引物浓度、 探针浓度、 最佳退火温度、 灵敏度 以及检测特异性等方面进行研究， 建立了微滴式 数字PCR检测ILTV的绝对定量方法， 为定量检测 ILTV提供了技 术支撑。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图3页 CN 114703327 A 2022.07.05 CN 114703327 A 1.应用， 其特 征在于： 所述应用为组合物在 如下任一种所述的应用： P1)检测或辅助检测鸡传染性喉气管炎病毒； P2)制备检测或辅助检测鸡传染性喉气管炎病毒的产品； P3)检测或辅助检测待测样本是否感染鸡传染性喉气管炎病毒； P4)制备检测或辅助检测待测样本是否感染鸡传染性喉气管炎病毒的产品； P5)检测或辅助检测待测病原是否为鸡传染性喉气管炎病毒； P6)制备检测或辅助检测待测病原是否为鸡传染性喉气管炎病毒的产品； 所述组合物包括鸡传染性喉气管炎病毒引物探针， 所述鸡传染性喉气管炎病毒引物探针包括引物ILTV ‑F、 引物ILTV ‑R和探针ILTV ‑ Probe， 所述引物I LTV‑F为核苷酸序列是SEQ  ID No.2的单链DNA； 所述引物I LTV‑R为核苷酸序列是SEQ  ID No.3的单链DNA； 所述探针I LTV‑Probe的核苷酸序列是SEQ  ID No.4。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述ILTV ‑F、 ILTV‑R、 ILTV‑Probe的物质的 量比值为2:2:1。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于： 所述数字PCR试剂或试剂盒还包括阳性 标准品质粒。 4.根据权利要求3所述的的应用， 其特征在于： 所述阳性标准品质粒包括核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示的DNA分子 。 5.组合物， 其特征在于： 所述组合物包括权利要求1 ‑4中任一项所述的鸡传染性喉气管 炎病毒引物探针。 6.根据权利要求5所述的组合物， 其特征在于： 所述的组合物中， 所述ILTV ‑F、 ILTV‑R、 ILTV‑Probe的物质的量比值 为2:2:1。 7.根据权利要求5或6所述的组合物， 其特征在于： 所述的组合物还包括阳性标准品质 粒。 8.根据权利要求5 ‑7中任一项所述的组合物， 其特征在于： 所述的组合物中， 所述阳性 标准品质粒包括核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示的DNA分子 。 9.检测或辅助检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法， 其特征在于： 所述方法包括用权利 要求5‑8中任一项所述的组合物对待测样 品进行数字PCR， 根据数字PCR产物确 定或辅助确 定待测样品是否为鸡传染性喉气管炎病毒或， 是否含有鸡传染性喉气管炎病毒或， 是否感 染鸡传染性喉气管炎病毒。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于： 所述数字PCR中采用的引物退火条件为56 ℃1分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703327 A 2检测鸡传染性喉 气管炎病毒 的组合物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物的测定或检验方法其所用的组合物技术领域， 具体涉及检测 鸡 传染性喉气管炎病毒的组合物及其应用。 背景技术 [0002]鸡传染性喉气管炎病毒(infect ious laryngotracheitis  virus,ILTV)属于疱疹 病毒亚科传染性喉气管炎病毒属， 主要引起鸡上呼吸道病， 其主要 特征为呼吸困难、 咳嗽和 咳出含有血液的渗出物。 剖检病鸡可见喉部和气管黏膜肿胀、 出血， 并形成糜烂。 该病毒极 易感染鸡， 鸡群一旦感染此病毒， 传播迅速， 短时间至90％以上鸡感染， 病死率可达20％或 以上， 造成很大 经济损失。 [0003]近年来， 随着鸡场中ILTV疫苗 的普遍使用， 鸡群中ILTV感染后的症状也出现了变 化， 以温和型病例多见， 其症状和病变极易与其他一些呼吸道疾病如禽流感、 新城疫、 传染 性支气管炎等相混淆,单凭临床症状很难作出鉴定， 需要进一步借助实验室方法， 但目前 ILTV鉴定方法智能定性， 还不能做到绝对定量检测。 [0004]自1985年聚合酶链反应(PC R)检测问世以来， 已被广 泛应用于生物 学、 医学等各个 领域。 随着生物 技术的飞速发展和技术进步， PCR技术已发展到荧光定量PCR(qPCR)技术， 现 今又发展到微滴数字PCR(ddPCR)技术。 ddPCR技术是将样品分为油包水型的数百个甚至数 百万个独立的反应单元， 进而对所有独立的反应单元中包含或者不包含1个或多个拷贝的 DNA模板分子进行平行扩增， 在扩增结束后读取各个反应单元的阴性或者阳性荧光信号采 用终点定量的方法进 行分析， 按泊松分布的统计学方法计算出原始样本的模板拷贝数从而 达到绝对定量的目的。 [0005]微滴式数字PCR(droplet  digital PCR， ddPCR)是近几年出现的新一代聚合酶链 式反应(polymerase  chain reaction， PCR)技术。 利用油包水技术将反应液分割为数万个 纳米级大小的微滴， 每一个微滴 都是一个独立的P CR反应体系， 当PCR扩增完成后， 利用微滴 分析仪逐个对每个微滴进 行检测， 再根据统计学中的泊松分布原理分析阳性微滴的个数与 比例， 即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度， 从而实现对低至单个拷贝核酸分子的绝对定 量。 与传统实时荧光定量PCR(quantitative  real‑time PCR， qPCR)方法相比， 它不依赖于 标准曲线， 因而定量结果更为精确， 同时也使体系受反应抑制因子的影响大 大降低。 发明内容 [0006]本发明要解决的技 术问题是如何实现鸡传染性喉气管炎病毒的临床 样品检测。 [0007]为解决上述技术问题， 第一个方面， 本 发明提供一种应用， 所述应用为组合物在如 下任一种所述的应用： [0008]P1)检测或辅助检测鸡传染性喉气管炎病毒； [0009]P2)制备检测或辅助检测鸡传染性喉气管炎病毒的产品； [0010]P3)检测或辅助检测待测样本是否感染鸡传染性喉气管炎病毒；说　明　书 1/8 页 3 CN 114703327 A 3