(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210319965.1 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 张仕斌 地址 563000 贵州省遵义市汇川区大连路 医新居9组1本 6号 (72)发明人 张仕斌　唐克桐　秦廷洋　龙红　 代军　 (74)专利代理 机构 重庆市信立达专利代理事务 所(普通合伙) 50230 专利代理师 包晓静 (51)Int.Cl. C12N 15/12(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G01N 33/68(2006.01) A01K 67/02(2006.01) A01K 29/00(2006.01) (54)发明名称 一种引起耳聋的豪猪MITF突变基因、 鉴定方 法及应用 (57)摘要 本发明属于生物基因技术领域， 公开了一种 引起耳聋的豪猪MITF突变基因、 鉴定方法及应 用， 所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因为M ‑ MITFR217del， 位于Mitfc.875_877delGAA； 所述 引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法包括： 将突变豪猪个体扩群繁育并进行显性遗传验证， 建立家系群体； 进行模型家系突变个体临床特性 和表型评估； 进行模型家系致病基因和突变位点 鉴定； 比较模 型与人相应临床病例的相似性并对 突变位点进行精细定位； 进行转录组及蛋白组学 检测及分析。 本发明成功鉴定了自发色素异常综 合征型耳聋突变豪猪的致病基因， 创建了遗传稳 定、 生物学特性明确的遗传性耳聋大动物模型家 系， 具有应用价 值。 权利要求书2页 说明书20页 序列表1页 附图5页 CN 115044589 A 2022.09.13 CN 115044589 A 1.一种引起耳聋的豪猪MITF突变基因， 其特征在于， 所述引起耳聋的豪猪MITF突变基 因为M‑MITF R217del， 位于 Mitfc.875_87 7delGAA； 豪猪Mitf基因CD S序列为SEQ  ID NO： 2。 2.一种应用如权利要求1所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的引起耳聋的豪猪MITF突 变基因的鉴定方法， 其特征在于， 所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法包括以下 步骤： 步骤一， 将突变豪猪 个体扩群繁 育并进行显性遗传验证， 建立家系群 体； 步骤二， 进行模型家系突变 个体临床特性和表型评估； 步骤三， 进行模型家系致病基因和突变位 点鉴定； 步骤四， 比较模型与人相应临床病例的相似性并对突变位 点进行精细定位； 步骤五， 进行转录组及蛋白组学检测及分析。 3.如权利要求2所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法， 其特征在于， 步骤一 中， 所述将突变豪猪 个体扩群繁 育并进行显性遗传验证， 建立家系群 体， 包括： 采用突变雄性豪猪与野生型雌性豪猪交配， F1代包括野生型个体和突变个体， 初步判 断遗传模式为显性遗传， 且突变雄性豪猪为显性杂合子； 采用4头突变雄性豪猪， 即显性杂 合子与野生型雌性豪猪交配进 行扩群繁育， 并建立遗传 模式明确为常染色体显性稳定遗传 的具有一定数量规模的家系群体； 白化耳聋突变豪猪家系扩群繁育成功后， 遗传学验证确 定遗传模式为单基因显性遗传， 遗传学卡方检验表明符合显性遗传； 其中， 所述遗传学卡方 检验公式如下： 4.如权利要求2所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法， 其特征在于， 步骤二 中， 所述模型家系突变 个体临床特性和表型评估， 包括： ①大体外观检查； ②皮肤、 视网膜病理形态学检查； ③听功能检查； ④内耳病理形态学 检查。 5.如权利要求2所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法， 其特征在于， 步骤三 中， 所述模型家系致病基因和突变位 点鉴定， 包括： (1)无参转录组测序调取候选基因mRNA序列确定； (2)BSA法性状定位分析； (3)突变位 点筛选并进行Sanger测序验证。 6.如权利要求5所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(2) 中， 所述BSA法性状定位分析， 包括： 针对目标性状， 选择表型极端差异显著 的亲本构建出分离群体或家系群体； 从分离群 体中选取 目标性状表型极端的一定数量的单体， 混合构建两个DNA池； 对所述DNA池进行全 基因组重测序， 检测 到的两池间DNA差异片段即为候选区域， 所关注的基因或者QTL分子标 记存在于该候选区域中。 7.如权利要求5所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(3) 中， 所述突变位点筛选并进行Sanger测序验证， 包括： 1)以MITF为 候选基因， 筛 选SNP及I nDel位点；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044589 A 22)设计引物对所述候选突变位点所处PVJO010006423.1片段77566处上下游区域进行 扩增； 其中， 所述引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示； 3)对扩增后的个 体样本进行Sanger测序验证。 8.如权利要求2所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法， 其特征在于， 步骤四 中， 所述比较模型与人相应临床病例的相似性并对突变位 点进行精细定位， 包括： (1)通过查询人耳聋相 关基因突变数据库， 将鉴定的白化耳聋豪猪MITF基因突变位点 进行比对， 同时结合文献进行分析； (2)将转录组测序提取的MITF基因的转录 本与人M‑MITF mRNA比对。 9.如权利要求2所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因的鉴定方法， 其特征在于， 步骤五 中， 所述转录组及蛋白组学检测及分析， 包括： 利用无参转录组、 蛋白组学差异表达检测分析技术， 筛选突变耳聋豪猪致病基因的下 游调控基因及表达情况； 利用获得的组学数据进 行定量、 定性以及功能层面的关联分析， 构 建致病突变 基因调控的分子通路， 确定发病机制。 10.一种如权利要求1所述引起耳聋的豪猪MITF突变基因在遗传性耳聋大动物模型家 系构建中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044589 A 3