(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210315056.0 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 申请人 江苏大学　东营市畜牧兽医站 (72)发明人 李文良　恽佳蕾　蒋康富　王少辉　 邹彬　何苗锋　毛立　杨蕾蕾　 张纹纹　孙敏　刘茂军　程子龙　 (74)专利代理 机构 南京汇盛专利商标事务所 (普通合伙) 32238 专利代理师 袁静 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的引物组合 物及试剂盒 (57)摘要 本发明提供检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌 的引物组合物及试剂盒， 属于生物 技术和分子生 物学领域。 该检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的 引物组合物， 包括引物对A、 引物对B和引物对C， 所述引物对A包括引物1和引物2， 所述引物对B包 括引物3和引物4， 所述引物对C包括引物5和引物 6， 所述引物1 ‑6的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO: 1‑6所示。 本发明试剂盒操作简单、 特异性强、 敏 感性高、 能同时检测O8、 O9及O89血清型大肠杆菌 的引物组合物及试剂盒。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 114540523 A 2022.05.27 CN 114540523 A 1.一种检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的引物组合物， 其特征在于， 所述引物组合物包 括引物对A、 引物对B和引物对C， 所述引物对A包括引物1和引物2， 所述引物对B包括引物3和 引物4， 所述引物对C包括引物5和引物6， 所述引物1 ‑6的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO:1‑6 所示。 2.根据权利要求1所述检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的引物组合物， 其特征在于， 引 物1、 引物 2、 引物3、 引物4、 引物5和引物6的浓度比为2： 2： 5： 5： 5： 5 。 3.检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的试剂盒， 其特征在于包括引物引物2、 引物3、 引物 4、 引物5和引物6， 所述引物1 ‑6的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO:1‑6所示。 4.根据权利 要求3所述检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的试剂盒， 其特征在于所述试剂 盒还包括2×Rapid Taq Master Mix和O8、 O9、 O89阳性标准品。 5.根据权利 要求4所述检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的试剂盒， 其特征在于所述引物 1和引物2的浓度为 4 μmol/L， 引物3 ‑6的浓度为10 μmo l/L。 6.以非诊断为目的采用权利 要求5所述试剂盒检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的方法， 其特征在于包括如下步骤： (1)提取待测样本的核酸； (2)以待测样本的核酸 为模板， 采用引物1 ‑6， 进行三重PCR反应； (3)将扩增产物进行电泳， 若扩增产物中出现了210bp的条带， 则待测样本中存在O8血 清型大肠杆菌； 若扩增产物中出现了411bp的条带， 则待测样本中存在O9血清型大肠杆菌； 若扩增产物中出现了126bp的条 带， 则待测样本中存在O89血清型 大肠杆菌 。 7.根据权利要求6所述方法， 其特征在于所述三重PCR反应体系如下： 2 ×Rapid Taq  Master Mix 10 μL， 引物1、 2、 3、 4、 5和6 各1 μL， 待检样本的核 酸2 μL， 去离子水补至体积为20 μ L。 8.根据权利 要求7所述方法， 其特征在于三重PCR反应程序如 下： 94℃预变性5min； 94℃ 30s， 54℃3 0s， 72℃20s， 共3 5个循环； 最后72℃延伸5mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540523 A 2检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的引物组合物及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物技术和分子生物学领域， 具体涉及检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆 菌的引物组合物及试剂盒。 背景技术 [0002]致病性大肠杆菌(pathogenic  Escherichia  coli)是养殖业常见的细菌之一， 不 仅对养殖产业带来严重影响， 而且对公共卫生安全带来一定威胁。 肠道致病性大肠杆菌引 起的腹泻以及肠外致病性大肠杆菌引起的肺炎等严重影响动物的成活率和养殖效益， 加上 细菌耐药性的日益普遍和严重， 以大肠杆菌为代表的细菌病每年 都给养殖业造成较大的经 济损失。 相较于 养猪业和养禽 业， 羊源大肠杆菌的研究及相应 检测技术明显滞后。 [0003]大肠杆菌抗原复杂， 主要有菌体抗原(O)、 荚膜抗原(K)、 鞭毛抗原(H)和菌毛抗原 (F)等， 其中O抗原是最为常用的分型抗原且与大肠杆菌致病性相关。 大肠杆菌血清型鉴定 的经典方法是采用凝集试验， 但此方法需要各血清型菌株的标准血清， 且结果受血清质量 与主观判断影响较大， 易出现假阴性与假阳性的情况， 准确性较低， 不利于临床诊断。 相比 之下， PCR方法具有更高的准确性及特异性， 更适合用于菌株血清型的鉴定。 研究表明不同 动物感染大肠杆菌的优势血清型有一定差异， 已有的方法 并不适用于所有动物源大肠杆菌 的鉴定。 通过对养殖场、 屠宰场采集的羊源大肠杆菌的研 究， 发现O8、 O9、 O89血清型大肠杆 菌为流行的优势血清型。 但是， 现有技术中缺乏能够高敏感性、 高特异 性检测O8、 O9和O89的 引物组合物和试剂盒。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种操作简单、 特异性高、 敏感性高、 能同时检测O8、 O9及O89 血清型大肠杆菌的引物组合物及试剂盒。 [0005]本发明的目的采用如下技 术方案实现： [0006]一种检测O8、 O9、 O89 血清型大肠杆菌的引物组合物， 包括引物对A、 引物对B和引物 对C， 所述引物对A包括引物1和引物2， 所述引物对B包括引物3和引物 4， 所述引物对C包括引 物5和引物6， 所述引物1 ‑6的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO:1‑6所示。 [0007]在本发明 中， 引物1、 引物 2、 引物3、 引物4、 引物5和引物6的浓度比为2： 2： 5： 5： 5： 5 。 [0008]本发明还提供检测O8、 O9、 O89血清型大肠杆菌的试剂盒， 包括引物1、 引物2、 引物 3、 引物4、 引物5和引物6， 所述引物1 ‑6的核苷酸序列依次如SEQ  ID NO:1‑6所示。 [0009]在本发明中， 所述试剂盒还包括2 ×Rapid Taq Master Mix和O8、 O9、 O89阳性标准 品。 其中， 2 ×Rapid Taq Master Mix可以替换成其 他有相同功能的PCR缓冲液。 [0010]在本发明 中， 所述引物1和引物 2的浓度为 4 μmol/L， 引物3 ‑6的浓度为10 μmo l/L。 [0011]本发明还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测O8、 O9、 O89 血清型大肠杆菌的 方法， 包括如下步骤： [0012](1)提取待测样本的核酸；说　明　书 1/7 页 3 CN 114540523 A 3