(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210323326.2 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 苏州吉玛 基因股份有限公司 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区 东平街19 9号 (72)发明人 饶品彬　马静　张佩琢　 (74)专利代理 机构 北京三聚阳光知识产权代理 有限公司 1 1250 专利代理师 刘静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种定量测定样本中核酸含量的方法 (57)摘要 本发明涉及一种定量测定样本中核酸含量 的方法， 属于PCR检测技术领域。 本发明提供了一 种定量测定样本中核酸含量的方法， 所述方法为 在实时荧光定量PCR的基础上结合数字定量PCR， 先用数字定量PCR辅助实时荧光定量PCR制备标 准品， 再用实时荧光定量PCR对测定样本中的待 测核酸进行定量检测。 所述方法以ddPCR绝对定 量的拷贝数， 可以校正qPCR中用于制作标准曲线 的标准品浓度， 进 一步提高qPCR绝对定量的样本 检测准确度； 针对一些标准品的制作过程繁琐的 样本检测， 所述方法可以利用经dPCR绝对定量的 样本直接作为标准品， 进行其他样本的定量， 保 证了模板扩增基质的一致性， 可以提高定量检测 准确度。 权利要求书2页 说明书13页 序列表3页 附图3页 CN 114958984 A 2022.08.30 CN 114958984 A 1.一种定量测定样本中核酸含量的方法， 其特征在于， 所述核酸为DNA或RNA； 当核酸为 DNA时， 所述方法包括如下步骤： 步骤一： 提取待测样本的总DNA， 得到DNA样本； 步骤二： 将步骤一得到的DNA样本稀释至数字定量PCR的检测范围内后， 对步骤一得到 的DNA样本进行 数字定量PCR检测， 得到待测样本中待测核酸的DNA浓度； 步骤三： 根据步骤二测得的待测样本中待测核酸的DNA浓度， 将待测样本进行梯度稀 释， 得到待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本； 步骤四： 对步骤三得到的浓度呈梯度的DNA稀释样本进行实时荧光定量PCR检测， 得到 与各待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值； 步骤五： 以待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本中待测核酸的DNA浓度为横坐标， 以步 骤五测得的与各待测核酸DNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值 为纵坐标， 绘制标准曲线； 步骤六： 将步骤一得到的DNA样本稀释至实时荧光定量PCR的检测范围内后， 对步骤一 得到的DNA样 本进行实时荧光定量P CR检测， 得到DNA样 本的Ct值， 并将测得的Ct值带入步骤 六绘制得到的标准曲线， 得到测定样本中待测核酸的DNA浓度； 当核酸为RNA时， 所述方法包括如下步骤： 步骤一： 提取待测样本的总RNA， 并对提取 得到的总RNA进行逆转录， 得到 cDNA样本； 步骤二： 将步骤一得到的cDNA样本稀释至数字定量PCR的检测范围内后， 对步骤一得到 的cDNA样本进行 数字定量PCR检测， 得到待测样本中待测核酸的RNA浓度； 步骤三： 根据步骤二测得的待测样本中待测核酸的RNA浓度， 将待测样本进行梯度稀 释， 得到待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本； 步骤四： 对步骤三得到的待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本进行逆转录， 得到的浓度 呈梯度的cDNA稀释 样本； 步骤五： 对步骤四得到的浓度呈梯度的cDNA稀释样本进行实时荧光定量PCR检测， 得到 与各待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值； 步骤六： 以待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本中待测核酸的RNA浓度为横坐标， 以步 骤五测得的与各待测核酸RNA浓度呈梯度的待测样本对应的Ct值 为纵坐标， 绘制标准曲线； 步骤七： 将步骤一得到的cDNA样本稀释至实时荧光定量PCR的检测范围内后， 对步骤一 得到的cDNA样 本进行实时荧光定量PCR检测， 得到cDNA样 本的Ct值， 并将测得的Ct值带入步 骤六绘制得到的标准曲线， 得到测定样本中待测核酸的RNA浓度； 所述数字定量PCR检测和实时荧光定量PCR检测所用上游引物、 下游引物和探针以待测 核酸为靶点。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述数字定量PCR检测的反应体系由10μL  4 ×Probe PCR Master Mix、 1.6 μL浓度10 μM的上游引物、 1.6 μL浓度10 μM的下游引物、 1μL浓 度10 μM的探针、 5.8 μL  RNase‑free water和20 μLcDNA样本模板组成。 3.如权利要求1或2所述的方法， 其特 征在于， 所述数字 定量PCR检测的反应程序如下： Hot： 94℃3mi n； 40cycle： 94℃12s， 62℃3 0s， 72℃3 0s。 4.如权利要求1～3任一项所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR检测的反应 体系由2 μL  10×PCR Buffer、 0.2 μL浓度10 mM的dNTPs、 2 μL浓度25 mM的MgCl2、 0.3 μL浓度20 μ权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958984 A 2M的上游引物、 0.3μL浓度20μM的下游引物、 0.6μL浓度10μM的探针、 0.4μL  50×ROX、 0.2μL   Taq酶、 4 μL  DEPC水和10 μLcDNA稀释 样本模板组成。 5.如权利要求1～4任一项所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR检测的反应 程序如下： Hot： 94℃3mi n； 40cycle： 94℃12s， 62℃3 0s， 72℃3 0s。 6.如权利 要求1～5任一项所述的方法， 其特征在于， 所述待测核酸为ACTB基因； 所述上 游引物、 下游引物和探针的核苷酸序列分别为SEQ  ID NO:11、 SEQ  ID NO:12和SEQ  ID NO: 13。 7.如权利要求1～6任一项所述的方法， 其特征在于， 所述逆转录的反应体系由5μL   RNase‑free ddH2O、 10 μL 2×RT Mix、 2 μL HiScript II Enzyme Mix、 1 μL浓度50 μM的Oligo (dT)23VN、 1 μL浓度5 0ng/ μL的Random  hexamers、 1 μL总RNA模板组成。 8.如权利要求1～7任一项所述的方法， 其特 征在于， 所述逆转录的反应程序如下： 26℃30min， 42℃40mi n， 85℃10mi n。 9.一种定量测定样本中核酸含量的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的成分包含逆转 录所需试剂， 数字PCR所需试剂， 实时荧光定量PCR试剂， 以及， 以待测核酸为靶点的上游引 物、 下游引物和探针。 10.权利要求1～8任一项所述的方法或权利要求9所述的试剂盒在定量测定样本中核 酸含量中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958984 A 3