(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210316627.2 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 中国检验检疫科 学研究院 地址 102600 北京市大兴区经济技 术开发 区荣华南路11号院 (72)发明人 赵可心　马雪征　刘莹莹　胡孔新　 (74)专利代理 机构 北京宣言律师事务所 1 1509 专利代理师 张紫晔 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/25(2006.01) (54)发明名称 一种植物乳杆菌检测的引物探针组合、 RPA 检测试剂盒及其检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种用于植物乳杆菌检测的 引物探针组合， 其特征在于， 所述上、 下游引物的 核苷酸序列分别如SEQ  ID NO.1、 2所示， 基因探 针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的。 本发明 提供的引物探针针对植物乳杆菌基因组保守区 域设计并经过筛选， 具有良好的特异性和灵敏 度， 检出限低。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图5页 CN 114752692 A 2022.07.15 CN 114752692 A 1.一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合， 其特征在于， 所述上、 下游引物的核苷酸 序列分别如SEQ  ID NO.1、 2所示， 基因探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 上、 下引物应用于PCR反应 中的终 浓度为0.4 μM， 荧 光探针应用于PCR反应中的终浓度为0.12 μM 。 3.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述SEQ  ID NO.3即荧光标记探 针序列5’端起第34位碱基标记FAM荧光基团， 第35位为无碱基位点， 第37位碱基标记BHQ1猝 灭基团。 4.一种将权利要求1所述的引物探针组合用于植物乳杆菌RPA检测试剂盒的应用。 5.一种采用权利要求1所述的引物探针组合的植物乳杆菌RPA检测试剂盒， 其特征在 于， 包括权利要求1所述的引物探针组合， 还包括快速核酸释放剂、 缓冲液体系A、 缓冲液体 系B和干粉反应管。 6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌RPA检测试剂盒， 其特征在于， 所述快速核酸释放 剂包括质量浓度为1mg/mL～20mg/mL的溶菌酶、 体积百分比为1％～5％的聚乙二醇、 摩尔浓 度为0.5mM～5mM的二硫苏糖醇和摩尔浓度为1mM～10mM的Tris ‑HCl。 7.根据权利要求5所述的植物乳杆菌RPA检测试剂盒， 其特征在于， 所述缓冲液体系A包 括PEG‑6000和无核酸 酶水， 所述 缓冲液体系B包括醋酸镁和无核酸 酶水， 所述干粉反应管包 含单链DNA结合蛋白、 重组酶、 链置换DNA聚合酶、 海藻糖、 PEG ‑6000和dNTPs。 8.一种利用权利要求4 ‑7任一项所述植物乳杆菌RPA检测试剂盒的检测方法， 包括以下 步骤： (1)将待测样本与快速核酸释放剂充分混合， 核酸释放剂与样本的混合比例为3： 3～ 20， 混合物于25℃～ 95℃孵育1～10mi n， 完成核酸释放； (2)向每个反应管中依次加入29.4μL缓冲液体系A、 2 μL上游引物、 2 μL下游引物、 0.6μL 荧光探针和8.5 μL无核酸酶水； (3)向每个反应管中加入5 μL样本与核酸释放剂的混合物； (4)向每个反应管中加入2.5μL缓冲液体系B， 混匀并离心后， 进行上机检测， 反应程序 为： 42℃反应20mi n， 每30s读取一次荧 光值， 判断植物乳杆菌是否检出。 9.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(4)中先判断扩增过程中是否产 生指数扩增曲线， 未产生指数扩增曲线则判定为阴性； 产生指数扩增曲线， 按照下表进行判读： 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752692 A 2一种植物乳杆菌检测的引物探针组合、 R PA检测试剂盒及其检 测方法 技术领域 [0001]本发明属于微生物检测技术领域， 具体涉及一种用于植物乳杆菌检测的引物探针 组合、 RPA检测试剂盒以及检测方法。 背景技术 [0002]乳杆菌为革兰氏阳性、 厌氧或兼性厌氧、 无芽孢杆菌， 在自然界中分布广泛。 植物 乳杆菌是乳杆菌的一种， 与其他乳杆菌相比， 该菌活性较高， 能大量产酸。 科学研究表明， 植 物乳杆菌对多种致病菌具有抑制作用， 它通过与病原菌竞争限制性营养素来抑制病原菌生 长， 还通过其生产的乳酸、 双乙酰等物质对其他细菌产生作用， 调节肠道菌群之 间的关系以 及微生态的组成。 作为一种益生菌， 植物乳杆菌还具有多种保健作用， 如调节免疫功能、 促 进营养物质吸收、 缓解乳糖不耐受症、 抑制肿瘤细胞形成和降低血清胆固醇从而预防心血 管疾病等。 此外， 植物乳杆菌还广泛应用于食品发酵、 生物防腐等领域， 是一种新型的绿色 添加剂。 相关产业具有广阔的应用前 景。 [0003]目前， 常规益生菌检测主要通过生化反应和选择性培养计数等方法进行， 不够快 速准确， 限制了益生菌产品的发展和应用。 随着分子生物学技术的快速发展， 以序列扩增为 基础的核酸检测方法得到广泛应用。 其中， 重组酶聚合酶扩增(RPA)技术具有成本低、 速度 快、 灵敏度高等优势， 将该技术应用于植物乳杆菌检测， 能够 减少检测成本、 简化 实验流程、 提高结果 准确率， 为 益生菌产业发展助力。 发明内容 [0004]为了克服现有技术上的问题， 本发明提供一种用于植物乳杆菌检测的引物探针 组 合、 RPA检测试剂盒以及检测方法， 特异 性强， 灵敏度高， 重复性好， 简化检测步骤、 提高检测 效率。 [0005]本发明提供以下技 术方案： [0006]一种用于植物乳杆菌检测的引 物探针组合， 所述上、 下游引 物的核苷酸序列分别 如SEQ ID NO.1、 2所示， 基因探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的。 [0007]进一步的， 上、 下引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μM， 荧光探针应用于PCR反 应中的终浓度为0.12 μM 。 [0008]进一步的， 所述SEQ  ID NO.3即荧光标记探针序列5 ’端起第34位碱基标记FAM荧光 基团， 第3 5位为无碱基位 点， 第37位碱基标记BHQ1猝灭基团。 [0009]一种将引物探针组合用于植物乳杆菌RPA检测试剂盒的应用。 [0010]一种采用引物探针组合的植物乳杆菌 RPA检测试剂盒， 包括权利要求1所述的引物 探针组合， 还 包括快速核酸释放剂、 缓冲液体系A、 缓冲液体系B和干粉反应管。 [0011]进一步的， 所述快速核酸释 放剂包括质量浓度为1m g/mL～20m g/mL的溶菌 酶、 体积 百分比为1％～5％的聚乙二醇、 摩尔浓度为0.5mM～5mM的二硫苏糖醇和摩尔浓度为1mM～说　明　书 1/6 页 3 CN 114752692 A 3