(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210324177.1 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 佛山科学技术学院 地址 528225 广东省佛山市南海区狮山 镇 广云路33号 (72)发明人 徐建琦　付强　余肇锋　胡俊冶　 张鹏举　张熙　马春全　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 孙怡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/06(2006.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 马链球菌兽疫亚种的实时荧光定量PCR检测 引物、 方法与应用 (57)摘要 本发明涉及分子生物学技术领域， 具体公开 了马链球菌兽疫 亚种的实时荧光定量PCR检测引 物、 方法与应用。 本发明的马链球菌兽疫亚种的 实时荧光定量PCR检测引物， 其核苷酸序列如SEQ   ID No.1‑2所示。 以该引物进行马链球菌兽疫亚 种的荧光定量PCR检测， 特异性好、 敏感度较高、 成本低且快速， 可用于大量样品检测。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 114736952 A 2022.07.12 CN 114736952 A 1.马链球菌兽疫亚种的实时荧光定量PCR检测引物， 其特征在于， 所述引物的核苷酸序 列如SEQ ID No.1‑2所示。 2.权利要求1所述的引物在制备马链球菌兽疫亚种检测试剂中的应用。 3.权利要求1所述的引物在制备马链球菌兽疫亚种检测试剂盒中的应用。 4.含有权利要求1所述的引物的试剂。 5.含有权利要求1所述的引物的试剂盒。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括SYBR  GreenⅡMix混 合液和阳性标准品， 所述阳性标准品为包 含马链球菌兽疫亚种的pgm基因的重组质粒。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述重组质粒的构建步骤包括： 提取、 PCR扩增、 回收马链球菌兽疫亚种的pgm基因， 将PCR产物克隆于pMD19 ‑T载体中， 获得重组质 粒pMD19T ‑SEZ。 8.一种非疾病诊断目的的检测马链球菌兽疫亚种的方法， 其特征在于， 以待测样品的 DNA作为模板， 利用权利要求1所述的引物进行荧 光定量PCR扩增。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR扩增的每20μL反应体系 包括： SYBR  GreenⅡMix(2×)10μL， 浓度为10μmol/L的上、 下游引物各0.6μL， 模板2μL， ddH2O 6.8 μL。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR扩增的反应程序为： (1)预变性： 9 5℃， 30s， 4.4℃/s， 1个循环； (2)PCR反应： 9 5℃， 5s， 4.4℃/s； 54℃， 30s， 2.2℃/ s； 72℃， 30s， 4.4℃/s， 共40循环； (3)溶解曲线： 95℃， 5s， 4.4℃/s； 60℃， 1min， 2.2℃/s； 95 ℃， 0s， 0.1 1℃/s。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114736952 A 2马链球菌兽 疫亚种的实时荧光定量PCR检测引物、 方 法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 具体地说， 涉及马链球菌兽疫亚种的实时荧光定 量PCR检测引物、 方法与应用。 背景技术 [0002]马链球菌兽疫亚种(Streptococcus  equi ssp.Zooepidemicus， SEZ)是猪链球菌 病的主要病原体之一， 属兰氏分群的C群链球菌， 呈阳性， 该菌主要引起马、 猪、 牛、 犬、 猫等 多种动物下呼吸道感染， 并引起败血症、 脑 膜炎、 关节炎等症状， 严重时会引起 突发性死 亡。 [0003]SEZ的感染流行范围广， 死亡率高。 除了对猪具有感染性外， 该菌还能够通过粪便 传播感染家禽， 导致家 禽产蛋率下降， 严重时引发猝死； 也有报道表示该病原能感染宠物龙 猫， 导致龙猫子宫出现脓肿的症状。 由此可见， SEZ的危害性极大， 对宿主没有特异性， 阻碍 了动物健康发展。 因此建立 一种准确、 灵敏、 快速的SEZ诊断方法具有重要的意 义。 [0004]目前SEZ诊断方法主要包括血清学和分子生物学等： 血清学诊断主要采用平板凝 集试验、 ELISA等方法。 但这些方法存在敏感度相对较低， 当抗体水平相对较低时， 无法检 测； 且需要专业人员进行操作， 既费时且成本高， 只能用于实验室的诊断， 不适合用于大量 样品的检测； 现有分子生物学诊断中建立的多重PCR检测技术只能区分马链球菌亚种与其 他猪链球菌且灵敏相对较低。 因此， 需要针对上述的缺陷进行改进。 发明内容 [0005]针对现有技术中存在的问题， 本发明的目的是提供一种敏感度较高、 成本低且快 速的用于大量样品检测的马链球菌兽疫亚种的检测方法。 [0006]为了实现本发明的目的， 本发明的技 术方案如下： [0007]马链球菌兽疫亚种的实 时荧光定量PCR检测引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.1‑2 所示。 [0008]本发明公开的一对特异性扩增引物， 可解决现有技术中所存在的一个或多个技术 问题， 至少提供了一种有益的选择或创造条件。 该特异性扩增引物对包含特异性扩增马链 球菌兽疫亚种的pgm基因的上游引物和下游引物。 本发 明采用pgm基因扩增引物建立了实时 荧光定量PCR方法， 可 快速检测SEZ引起的疾病， 便 于发现早期感染动物。 [0009]本发明的引物中， 上游引物qPGM ‑F的序列为5 ′ ‑CCCCGTAGCTCTCTGCAAT ‑3′(SEQ ID  NO.1)， 下游引物qP GM‑R的序列为5 ′ ‑GCAGACTGGGACGCTACC ‑3′(SEQ ID NO.2)。 其特异性扩 增的GPCR基因片段长度为89bp。 [0010]本发明还提供上述引物在制备马链球菌兽疫亚种检测试剂或试剂盒中的应用。 以 及含有上述引物的试剂或试剂盒。 [0011]本发明的试剂盒中， 还包括SYBR  GreenⅡMix混合液和阳性标准品， 所述阳性标准 品为包含马链球菌兽疫亚种的pgm基因的重组质粒。 [0012]优选， 所述重组质粒的构建步骤包括： 提取、 PCR扩增、 回收马链球菌兽疫亚种的说　明　书 1/4 页 3 CN 114736952 A 3