(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210317147.8 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 博迪泰 （厦门） 生物科技有限公司 地址 361000 福建省厦门市海沧区翁角西 路2066号厦门生物医药产业园B9 号楼 第3-4层 (72)发明人 郭剑光　尤倩倩　郭祥举　林康凤　 李清涵　翁娇　张睿　李博安　 (74)专利代理 机构 厦门市精诚新创知识产权代 理有限公司 3 5218 专利代理师 秦华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种恒温扩增结合熔解曲线法检测药物基 因组多态性的引物和分子信标探 针及其试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种恒温扩增结合熔解曲线 法检测药物基因组多态性的引物和分子信标探 针及其试剂盒。 其引物和分子信标探针的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:1‑9所示。 采用本发明的引物 和探针或试剂盒进行检测， 具有高特异性， 高灵 敏度， 快速 检测， 低污染， 结果 直观明了的特点。 权利要求书2页 说明书9页 序列表8页 附图6页 CN 114736955 A 2022.07.12 CN 114736955 A 1.一种恒温扩增结合熔解曲线法检测药物基因组多态性的引物和分子信标探针， 其特 征在于， 包括如下序列： 正向引物F1： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 反向引物R 1： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 正向引物F2： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 反向引物R2： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 正向引物F3： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 反向引物R3： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示； 分子信标探针P1： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示； 分子信标探针P2： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示； 分子信标探针P3： 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:9所示。 2.根据权利要求1所述恒温扩增熔解曲线法检测药物基因组多态性的引物和分子信标 探针， 其特征在于， 所述分子信标探针P1， 其寡核苷酸DNA分子的5 ’端标记荧光报告基团 FAM， 3’端标记荧 光淬灭基团DABC YL； 所述分子信标探针P2， 其寡核苷酸DNA分子的5 ’端标记荧光报告基团HEX， 3 ’端标记荧 光淬灭基团DABC YL； 所述分子信标探针P3， 其寡核苷酸DNA分子的5 ’端标记荧光报告基团ROX， 3 ’端标记荧 光淬灭基团DABC YL。 3.一种恒温扩增熔解曲线法检测药物基因组多态性的试剂盒， 其特征在于， 含有权利 要求1或2所述引物和分子信标探针。 4.如权利要求3所述试剂盒， 其特征在于， 还包括， 恒温扩增冻干反应管、 醋酸镁溶液、 复溶液； 优选的， 复溶 液为灭菌超纯 水。 5.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 所述恒温扩增冻干反应管的配方如下： Tris‑HCl pH8 10‑50mM、 potassiμM  acetate 20‑40mM、 PEG20K  10％‑30％、 ATP  3‑10mM、 phosphocreatine  20‑60mM、 creatine  kinase 100‑300ng/ μl、 DTT  2‑10mM、 dNTP  400‑800 μ M、 uvsX 600‑1000ug/ml、 uvsY  278‑500ug/ml、 gp32  10‑50mg/ml、 5000 ‑10000unit/ml  Bsu  polymerase、 正向引物F1  0.24‑1 μM、 反向引物R2  1.45‑2.5 μM、 正向引物F2  0.24‑1 μM、 反向 引物R2 1.45‑2.5μM、 正向引物F3  0.24‑1μM、 反向引物R3  1.45‑2.5μM、 分子信标探针P1   0.24‑1 μM、 分子信标探针P2  0.24‑1 μM、 分子信标探针P3  0.24‑1 μM。 6.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 所述恒温扩增冻干反应管的配方如下： Tris‑HCl pH8 10mM、 potassi μM  acetate 20mM、 PEG20K  10％、 ATP  3mM、 phosphocreatine   20mM、 creatine  kinase 100ng/ μl、 DTT  2mM、 dNTP  400 μM、 uvsX  600ug/ml、 uvsY  278ug/ml、 gp32 10ug/ml、 Bsu  polymerase  5000unit/ml、 正向引物F1  0.24 μM、 反向引物 R2 1.45 μM、 正向引物F2  0.24 μM、 反向引物R2  1.45 μM、 正向引物F3  0.24 μM、 反向引物R3  1.45 μM、 分子 信标探针P1  0.24 μM、 分子信标探针P2  0.24 μM、 分子信标探针P3  0.24 μM。 7.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 所述恒温扩增冻干反应管的冻干程序为： 冷冻第一阶段： ‑45℃100‑200分钟； 一次干燥第一阶段设定温度 ‑40‑‑‑20℃， 设定时间30 ‑60分钟， 持续时间200 ‑300分钟， 控制真空0.1500mbar； 第二阶段设定温度 ‑25‑‑‑10℃， 设定时间30 ‑60分钟， 持续时间250 ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114736955 A 2350分钟， 控制真空0.1000mbar； 第三阶段设定温度 ‑15‑‑‑10℃， 设定时间30 ‑60分钟， 持续 时间200‑300分钟， 控制真空0.10 00mbar； 解析干燥第一阶段设定温度0 ‑10℃， 设定时间20 ‑60分钟， 持续时间120 ‑200分钟， 控制 真空0.1000mbar； 第二阶段设定温度25 ‑30℃， 设定时间20 ‑60分钟， 持续时间90 ‑120分钟， 控制真空0.1000mbar； 压力升设定值0.020， 时间10 ‑30分钟； 压力升间隔设定值2， 时间10 ‑ 30分钟； 冷凝器制冷设定温度 ‑50.0℃～ ‑30℃， 持续时间5 ‑15分钟； 预抽真空0.2000， 报警 真空0.40 00， 报警真空持续时间3 00分钟。 8.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 所述恒温扩增冻干反应管的冻干程序如 下： 冷冻第一阶段： ‑45℃100分钟； 一次干燥第一阶段设定温度 ‑40℃， 设定时间30分钟， 持续时间200分钟， 控制真空 0.1500mbar； 第二阶段设定温度 ‑25℃， 设定时间30分钟， 持续时间250分钟， 控制真空 0.1000mbar； 第三阶段设定温度 ‑15℃， 设定时间30分钟， 持续时间200分钟， 控制真空 0.1000mbar； 解析干燥第一阶段设定温度0℃， 设定时间20分钟， 持续时间120分钟， 控制真空 0.1000mbar； 第二阶段设定温度25℃， 设定时间20分钟， 持续时间90分钟， 控制真空 0.1000mbar； 压力升设定值0.020， 时间10分钟； 压力升间隔设定值2， 时间10分钟； 冷凝器制 冷设定温度 ‑50.0℃， 持续时间5分钟； 预抽真空0.2000， 报警真空0.4000， 报警真空持续时 间300分钟。 9.根据权利要求3所述试剂盒， 其特 征在于， 还 包括空白对照。 10.根据权利要求9所述试剂盒， 其特 征在于， 所述空白对照为超纯灭菌水。 11.权利要求1～2任一所述引物和分子信标探针或权利要求3～9任一所述试剂 盒在制 备检测药物基因 组多态性药物中的应用。 12.一种以非疾病诊断和治疗为目的的检测人类CYP2C19基因多态性的方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： (1)提取待检样本的基因 组DNA， 作为DNA模板； (2)将上述权利 要求1或2的引物和探针、 或权利 要求3～9任一所述试剂盒和 PCR混合反 应液混合在一 起， 加入DNA模板， 进行荧 光PCR扩增反应； (3)反应结束后， 分析扩增产物的熔解曲线， 通过熔解峰的个数和Tm值来确定CYP2C19* 2位点、 CYP2C19*3位点和CYP2C19*17位 点的基因型； 当检测结果为Tm在60 ±1℃上有单一熔解峰时， CYP2C19*2位点为野生型； 当检测结果 为Tm在65 ±1℃上有单一熔解 峰时， CYP2C19*2位点为突变型； 当检测结果为Tm在60 ±1℃， 65±1℃上分别有单一熔解峰时， C YP2C19*2位 点为杂合基因型； 当检测结果为Tm在73 ±1℃上有单一熔解峰时， CYP2C19*3位点为野生型； 当检测结果 为Tm在69 ±1℃上有单一熔解 峰时， CYP2C19*3位点为突变型； 当检测结果为Tm在73 ±1℃， 69±1℃上分别有单一熔解峰时， C YP2C19*3位点为杂合基因型； 当检测结果为Tm在66 ±1℃上有单一熔解峰时， CYP2C19*17位点为野生型； 当检测结果 为Tm在58 ±1℃上有单一熔解峰时， CYP2C19*17位点为突变型； 当检测结果为Tm在66 ±1℃， 58±1℃上分别有单一熔解峰时， C YP