(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210322792.9 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 上海市同济医院 地址 200333 上海市普陀区新村路389号 (72)发明人 蒋明　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 田立媛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平 的引物组合物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测小鼠源性NRF2 基因表达 水平的引物组合物及其应用， 属于基因 检测技术领域。 本发明公开的一种用于检测小鼠 源性NRF2基因表达水平的引物组合物， 由用于 NRF2基因检测的引物组1和用于RPL19内参基因 检测的引物组2组成； 用于筛选RNA干扰序列。 本 发明用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平的方 法， 特异性强、 检测敏感性高、 操作方便简单、 准 确度更高、 检测时间短。 权利要求书1页 说明书7页 序列表4页 附图2页 CN 115011683 A 2022.09.06 CN 115011683 A 1.一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平的引物 组合物， 其特征在于， 由引物组1和 引物组2组成； 所述引物组1用于NRF2基因检测， 所述引物组2用于RPL19内参基因检测； 所述引物组1的序列如下： NRF2‑F： 5’ ‑AAAGCACAGC CAGCACAT TC‑3’； SEQ ID NO.1； NRF2‑R： 5’ ‑GGGATTCACGCATAG GAGCA‑3’； SEQ ID NO.2； 所述引物组2的序列如下： RPL19‑F： 5’ ‑CGAGCGAGCTCT TTCCTTT‑3’； SEQ ID NO.3； RPL19‑R： 5’ ‑AGACCTTCTTCTTGCCACAGC‑3’； SEQ ID NO.4。 2.根据权利要求1所述的一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平 的引物组合物， 其 特征在于， 所述引物组1的上游和下游引物浓度均为0.1 ‑0.5 μM。 3.根据权利要求1所述的一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平 的引物组合物， 其 特征在于， 所述引物组2的上游和下游引物浓度均为0.1 ‑0.5 μM。 4.权利要求1 ‑3任一项所述的引物组合物在检测小鼠源性NRF2基因表达水平的试剂中 的应用。 5.权利要求1 ‑3任一项所述的引物组合物在筛 选RNA干扰序列中的应用。 6.根据权利要求5所述的引物 组合物在筛选RNA干扰序列中的应用， 其特征在于， 采用2 ‑△△CT相对定量方法计算不同RNA干扰序列样品的NRF2基因表达水平， 筛选出表达水平最低 的RNA干扰序列。 7.一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑3 任一项所述的引物组合物和荧 光染料。 8.根据权利要求7所述的一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平 的试剂盒， 其特征 在于， 所述 荧光染料为SYBR  Green荧光染料。 9.一种非诊断治疗目的的用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平 的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)提取样品RNA； (2)将步骤(1)提取 出的RNA反转录成cDNA； (3)以权利要求1 ‑3中任一项所述的引 物组合物为引 物， 用荧光定量PCR法检测NRF2基 因以及RPL19内参基因表达水平； (4)分析结果。 10.根据权利要求9所述的一种非诊断治疗目的的用于检测小鼠源性NRF2基因表达水 平的方法， 其特征在于， 步骤(3)所述荧光定量PCR反应条件为95℃预变性5min； 95℃变性 10s， 60℃退火40s运行40个 循环； 最后40℃10s结束反应。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011683 A 2一种用于 检测小鼠源性NRF2基因表达水 平的引物组合物及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及 基因检测技术领域， 更具体的说是涉及一种用于检测小鼠源性NRF2基 因表达水平的引物组合物及其应用。 背景技术 [0002]核因子NF ‑E2相关因子(Nuclear  factor‑erythroid 2‑related factor 2， NRF2) 是调节细胞抗氧化应激的重要转录因子， 在生理情况下， 胞浆蛋白伴侣分子Keap1与NRF2结 合使其呈抑制状态， 在外界氧化应激源影响下， NRF2与Keap1解耦联后移入核内， 与抗氧化 反应元件结合， 启动其调控 的Ⅱ相解毒酶(SOD、 MDA、 NOS、 CAT、 GSH ‑PX等)和抗氧化酶基因 (HO‑1、 NRF2、 γ ‑GCS、 SOD、 NQO1等)的表达， 增加细胞对氧化应激的抵抗性从而发挥保护作 用。 [0003]NRF2由NFE2L2基因编码， 调节涉及细胞稳态的约250个基因， 包括抗氧化剂蛋白， 解毒酶， 药物转运蛋白和许多细胞保护蛋白。 研究表明NRF2 ‑ARE信号途径具有神经保护作 用。 叔丁基对 苯二酚(tBHQ)激活的NRF2 ‑ARE信号途径能保护成神经细胞瘤细胞免受氧化性 谷氨酸盐 的毒性和双氧水诱导的凋亡。 原代培养的NRF2 ‑/‑的小鼠的星形胶质细胞和神经 元较之野生型细胞,对氧化损伤、 钙离子紊乱和线粒体毒性更加易感。 Hwang等发现咖啡白 脂(kahweol)预 处理的神经细胞能够激活NRF2及其下游的HO1的表达,保护神经细胞免受帕 金森相关神经毒素6 ‑OHDA(6‑hydroxydopami ne)的损伤。 [0004]氧化应激与许多疾病的发生密切相关， 比如在神经退行性疾病阿尔茨海默氏病 (AD)中NRF2的表达水平下降， 细胞保护作用减弱。 研究表明在AD转基因小鼠模 型中， 随着Aβ 斑块的出现， NRF2总蛋白及核内表达水平均降低， 提示NRF2的表达抑制在AD的病理生理过 程中起重要作用。 一些对疾病的干预和治疗措施也可影响NRF2的表达， 因此通过对NRF2表 达水平的研究有助于明确疾病的发病机制和药物的药效机制。 [0005]对NRF2表达水平的研究 除采用免疫组化和Western免疫印迹等方法从蛋白水平进 行研究外， 也可从mRNA水平研 究NRF2的表达水平， 包括半定量反转录PCR和荧光定量PCR方 法等。 以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐， 耗时。 半定量反转录P CR需要电泳检测， 准确度不够高。 细胞管家基因需选择维持细胞最低限度功 能所不可少的基因， 在所有细胞 中均要表达的一类基因， 且表达水平受环境因素影响较小。 有研究表明比较 常用的actin管 家基因受氧化应激影响， 表达量会 减少， 不适宜用于氧化应激的参 考基因。 [0006]因此， 提供一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平的引物组合物及其应用是本 领域技术人员亟需解决的问题。 发明内容 [0007]有鉴于此， 本发明提供了一种用于检测小鼠源性NRF2基因表达水平的引物组合物 及其应用。说　明　书 1/7 页 3 CN 115011683 A 3