(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210318135.7 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市友爱 北路51号广西兽医研究所 (72)发明人 谢芝勋　谢志勤　张艳芳　范晴　 谢丽基　万丽军　罗思思　李孟　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 关畅 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 微滴式数字PCR检测鸡毒支原体的组合物及 其应用 (57)摘要 本发明公开了微滴式数字PCR检测鸡毒支原 体的组合物及其应用， 属于微生物的测定或检验 方法技术领域。 该组合物包括鸡毒支原体特异引 物探针， 所述鸡毒支原体特异引物探针由特异扩 增含有核苷酸序列是SEQ  ID No.1的DNA片段在 内的鸡毒支原 体基因组DNA片段的引物和与核苷 酸序列是SEQ  ID No.1的DNA片段特异结合的探 针组成。 本发明提提供的ddPCR检测的组合物灵 敏性高， 特异性强， 适用于低拷贝样品的检测。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图4页 CN 114703303 A 2022.07.05 CN 114703303 A 1.检测或辅助检测鸡毒支原体的组合物， 所述组合物包括鸡毒支原体特异引物探针， 所述鸡毒支原体特异引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ  ID No.1的DNA片段在内 的鸡毒支原体基因组DNA片段的PCR引物和与核苷酸序列是SEQ  ID No.1的DNA片段特异结 合的探针组成。 2.如权利 要求1所述的组合物， 其特征在于： 所述PCR引物由MG ‑F和MG‑R组成， 所述探针 为MG‑Probe， 所述MG‑F为核苷酸序列是SEQ  ID No.2的单链DNA； 所述MG‑R为核苷酸序列是SEQ  ID No.3的单链DNA； 所述MG‑Probe的核苷酸序列是SEQ  ID No.4。 3.如权利要求2或3所述 的组合物， 其特征在于： 所述MG ‑F、 MG‑R、 MG‑Probe的物质的量 比值为2:2:1。 4.权利要求1 ‑3中任一项所述的组合物在 如下A1)‑A6)中的应用： A1)制备检测或辅助检测鸡毒支 原体的产品； A2)制备检测或辅助检测待测样本是否感染鸡毒支 原体的产品； A3)制备检测或辅助检测待测病原是否为鸡毒支 原体的产品； A4)检测或辅助检测鸡毒支 原体； A5)检测或辅助检测待测样本是否感染鸡毒支 原体； A6)检测或辅助检测待测病原是否为鸡毒支 原体。 5.检测或辅助检测鸡毒支原体的试剂或试剂盒， 所述试剂或试剂盒包括权利要求1 ‑3 中任一组合物中所述的鸡毒支 原体特异引物探针。 6.如权利要求5所述的试剂 或试剂盒， 其特征在于： 所述试剂 或试剂盒还包括阳性标准 品质粒。 7.如权利要求6所述的试剂 或试剂盒， 其特征在于： 所述阳性标准品质粒包括核苷酸序 列如SEQ ID No.1所示的DNA分子 。 8.检测或辅助检测鸡毒支原体的方法， 其特征在于： 所述方法包括使用权利要求1 ‑3中 任一项所述的组合物或权利要求5 ‑7中任一项所述的试剂或试剂盒对待测样品进行数字 PCR， 根据数字PCR产物确定或辅助确 定待测样 品是否为鸡毒支原体或， 是否含有鸡毒支原 体或， 是否感染鸡毒支 原体。 9.如权利 要求8所述的方法， 其特征在于： 所述数字PCR采用的PCR体系中所述MG ‑F的含 量为1 μmol/ μL， 所述MG ‑R的含量为1 μmol/ μL， 所述MG ‑Probe的含量 为0.5 μmo l/ μL。 10.如权利要求8或9所述的方法， 其特征在于： 所述数字PCR中采用的引物退火条件为 55℃1分钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703303 A 2微滴式数字PCR检测鸡毒 支原体的组合物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于微生物的测定或检验方法技术领域， 具体涉及微滴式数字PCR检测鸡 毒支原体的方法。 背景技术 [0002]微滴式数字PCR(droplet  digital PCR， ddPCR)是近几年出现的新一代聚合酶链 式反应(polymerase  chain reaction， PCR)技术。 通过油包水技术将反应液分割为数万个 纳米级大小的微滴， 每一个微滴 都是一个独立的P CR反应体系， 当PCR扩增完成后， 利用微滴 分析仪逐个对每个微滴进 行检测， 再根据统计学中的泊松分布原理分析阳性微滴的个数与 比例， 即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度， 从而实现对低至单个拷贝核酸分子的绝对定 量。 与传统实时荧光定量PCR(quantitative  real‑time PCR， qPCR)方法相比， 它不依赖于 标准曲线， 因而定量结果更为精确， 同时也使体系受反应抑制因子的影响大 大降低。 [0003]鸡毒支原体(Mycoplasma  gallisept icam， 简称MG)常常引起鸡的慢性呼吸道传染 病， 各种鸡均可感染且感染率高， 以呼吸道发生罗音、 咳嗽、 流鼻液和窦部肿胀为特征。 与其 他呼吸道病原如禽流感、 新城疫等引起的症状相似 水， 给MG的诊断带来困难， 需要通过实验 室方法进 行区分， 但在病毒载量较低的情况下， 常规的方法也很难进 行诊断， 需要找到一种 对低拷贝的检测方法。 ddPCR方法 的出现， 满足了对低拷贝又能绝对定量检测的要求， 因此 建立ddPCR方法检测MG很有现实意 义。 [0004]自1985年聚合酶链反应(PC R)检测问世以来， 已被广 泛应用于生物 学、 医学等各个 领域。 随着生物 技术的飞速发展和技术进步， PCR技术已发展到荧光定量PCR(qPCR)技术， 现 今又发展到微滴数字PCR(ddPCR)技术。 ddPCR技术是将样品分为油包水型的数百个甚至数 百万个独立的反应单元， 进而对所有独立的反应单元中包含或者不包含1个或多个拷贝的 DNA模板分子进行平行扩增， 在扩增结束后读取各个反应单元的阴性或者阳性荧光信号采 用终点定量的方法进 行分析， 按泊松分布的统计学方法计算出原始样本的模板拷贝数从而 达到绝对定量的目的。 [0005]ddPCR与qPC R相比具有较高的灵敏度， 在样品浓度较低时能识别目的片段， 不需要 通过扩增反应的CT值和标准曲线来 实现核酸定量。 近几年， ddPCR技术已开始在动物疫病检 测中发挥了作用。 发明内容 [0006]本发明要解决的技 术问题是如何快速、 准确的检测样品是否感染鸡毒支 原体。 [0007]为解决上述技术问题， 第一个方面， 本发明提供检测或辅助检测鸡毒支原体 的组 合物， 所述组合物包括鸡毒支原体特异引物探针， 所述鸡毒支原体特异引物探针由特异扩 增含有核苷酸序列是SEQ  ID No.1的DNA片段在内的鸡毒支原体基因组DNA片段的PCR引物 和与核苷酸序列是SEQ  ID No.1的DNA片段 特异结合的探针组成。 [0008]进一步地， 上述的组合物中， 所述PCR引物由MG ‑F和MG‑R组成， 所述探针为MG ‑说　明　书 1/9 页 3 CN 114703303 A 3