(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210318131.9 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 广西壮族自治区兽医研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市友爱 北路51号广西兽医研究所 (72)发明人 谢芝勋　万丽军　王盛　任红玉　 谢丽基　谢志勤　邓显文　范晴　 罗思思　张艳芳　黄娇玲　曾婷婷　 张民秀　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 关畅 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测引物组合物 及其检测方法 (57)摘要 本发明公开了禽呼肠 孤病毒微滴数字PCR检 测引物组合物及其检测方法， 属于微生物的测定 或检验方法技术领域。 本发明提供检测或辅助检 测禽呼肠 孤病毒的引物及探针组合物， 所述引物 及探针组合物包括禽呼肠孤病毒引物探针， 所述 禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸 序列是SEQ  ID No.1的DNA片段在内的禽呼肠孤 病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是 SEQ ID No.1的DNA片段特异结合的探针组成。 本 发明提供的用于检测禽呼肠孤病毒的引物及探 针组合物具有高度的灵敏性， 检测线可为 10copies.μL‑1， 同时具有良好的特异性和重复 性。 适用于生产实 践中禽呼肠孤病毒的检测。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114703326 A 2022.07.05 CN 114703326 A 1.检测或辅助检测禽呼肠孤病 毒的数字PCR试剂 或试剂盒， 所述数字PCR试剂或试剂盒 包括禽呼肠孤病毒引物探针， 所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是 SEQ ID No.1第472 ‑551位的DNA片段在内的禽呼肠孤病毒基因组DNA片段的引物和与核苷 酸序列是SEQ  ID No.1第472 ‑551位的DNA片段 特异结合的探针组成。 2.如权利要求1所述的数字PCR试剂或试剂盒， 其特征在于： 所述禽呼肠孤病毒引物探 针包括引物 ARV‑F和引物ARV‑R、 探针ARV ‑Probe， 所述引物 ARV‑F为核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.2的单链DNA或其 衍生物； 所述引物 ARV‑R为核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.3的单链DNA或其 衍生物； 所述探针ARV ‑Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.4。 3.如权利要求1或2所述的数字PCR试剂或试剂盒， 其特征在于： 所述ARV ‑F、 ARV‑R、 ARV‑ Probe的物质的量比值 为4:4:1。 4.如权利 要求1‑3中任一项所述的数字PCR试剂或试剂盒， 其特征在于： 所述数字PCR试 剂或试剂盒还 包括阳性标准品质粒。 5.如权利要求4所述的数字PCR试剂或试剂盒， 其特征在于： 所述阳性标准品质粒包括 核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示的DNA分子 。 6.检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的组合物， 所述组合物包括禽呼肠孤病毒引物探针， 所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ  ID No.1第472 ‑551位的DNA 片段在内的禽呼肠孤病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ  ID No.1第472 ‑551 位的DNA片段 特异结合的探针组成。 7.如权利要求6所述的组合物， 其特征在于： 所述禽呼肠孤病毒引物探针包括引物ARV ‑ F和ARV‑R、 探针ARV ‑Probe， 所述ARV‑F为核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.2的单链DNA或其 衍生物； 所述ARV‑R为核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.3的单链DNA或其 衍生物； 所述ARV‑Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.4。 8.如权利要求6或7所述的组合物， 其特征在于： 所述ARV ‑F、 ARV‑R、 ARV‑Probe的物质的 量比值为分别为 4:4:1。 9.权利要求6 ‑8中任一项所述的组合物在 如下A1)‑A6)中的应用： A1)检测或辅助检测禽呼肠孤病毒； A2)检测或辅助检测待测样本是否感染禽呼肠孤病毒； A3)检测或辅助检测待测病原是否为 禽呼肠孤病毒； A4)制备检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的产品； A5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染禽呼肠孤病毒的产品； A6)制备检测或辅助检测待测病原是否为 禽呼肠孤病毒的产品。 10.检测或辅助检测禽呼肠孤病 毒的方法， 其特征在于： 所述方法包括使用权利要求1 ‑ 5中任一项 所述的数字P CR试剂或试剂盒或权利要求6 ‑8中任一项 所述的组合物对待测样品 进行数字PCR， 根据数字PCR产物确定或辅助确定待测样品是否为禽呼肠孤病毒或， 是否含 有禽呼肠孤病毒或， 是否感染禽呼肠孤病毒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703326 A 2禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测引物组合物及其检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于微生物的测定或检验方法技术领域， 具体涉及禽呼肠孤病毒微滴数字 PCR检测引物组合物及其检测方法。 背景技术 [0002]禽呼肠孤病毒(Avian  reovirus， ARV)是呼肠孤病毒 科(Reoviridae)， 正呼肠孤病 毒属(Orthoreovirus)的双链RNA病毒， 能够引起禽类病毒性关节炎、 腱鞘炎、 免疫抑制等疾 病。 ARV在商品禽类中极其常见， 其大部分毒株无致病性， 但和其他病原微生物混合感染将 会造成严重的后果， 在病死鸡中一般都能分离出ARV。 因此对于ARV的防控检测尤为重要。 [0003]微滴数字PCR(droplet  digital PCR， ddPCR)具有灵敏度强、 准确度高、 可绝对定 量且快速等优点。 目前ddP CR已广泛应用在基因突变、 病原微生物、 转基因食品、 肿瘤相关基 因检测等多方面， 尚未 见该技术应用在检测ARV病毒的报道。 发明内容 [0004]本发明要解决的技 术问题是如何快速、 准确的检测样品是否感染禽呼肠孤病毒。 [0005]为解决上述技术问题， 第一个方面， 本发明提供检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的 数字PCR试剂或试剂盒， 所述数字PCR试剂或试剂盒包括禽呼肠孤病毒引物探针， 所述禽呼 肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ  ID No.1第472 ‑551位的DNA片段在内 的禽呼肠孤病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ  ID No.1第472 ‑551位的DNA 片段特异结合的探针组成。 [0006]进一步地， 上述的数字PC R试剂或试剂盒中， 所述禽呼肠孤病毒引物探针包括引物 ARV‑F和引物ARV‑R、 探针ARV ‑Probe， [0007]所述引物 ARV‑F为核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.2的单链DNA或其 衍生物； [0008]所述引物 ARV‑R为核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.3的单链DNA或其 衍生物； [0009]所述探针ARV ‑Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ  ID No.4。 [0010]本发明中， 所述ARV ‑Probe为特异性识别禽呼肠孤病毒的探针， 所述ARV ‑Probe的 5'端连接有荧 光基团， 3'端连接有淬灭基团。 [0011]荧光基团可选自但不限于FAM(5/6 ‑羧基荧光素)、 VIC(绿色荧光蛋白)、 TET(四氯 ‑ 6‑羧基荧光素)、 JOE(2， 7 ‑二甲基‑4， 5‑二氯‑6‑羧基荧光素)、 HEX(六氯 ‑6‑甲基荧光素)、 Cy3、 TAMRA(6‑羧基四甲基若丹明)、 ROX(羧基 ‑X‑罗丹明)、 Texas  Red、 LC RED640、 Cy5(花菁 燃料)、 LC  RED705、 FITC(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团， 进行双重PCR检测引物组合物 中探针的荧 光基团的选择原则是两个荧 光的显色不同即可。 [0012]所述淬灭基团可选自TAMRA、 BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 MGB、 Dabcy1中的至少一种。 [0013]进一步地， 上述的数字PCR试剂或试剂盒中， 所述ARV ‑F、 ARV‑R、 ARV‑Probe的物质 的量比值 为4:4:1。 [0014]进一步地， 上述的数字PCR试剂或试剂盒中， 所述数字PCR试剂或试剂盒还包括阳说　明　书 1/7 页 3 CN 114703326 A 3