(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210320959.8 (22)申请日 2022.03.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114410797 A (43)申请公布日 2022.04.29 (73)专利权人 南京鼓楼医院 地址 210008 江苏省南京市中山路321号 (72)发明人 崔晓宾　赵琳玥　王文洁　陈云昭　 孙琦　丁友祥　禹洁　陈曦　李锋　 韩雪萍　孟凡青　 (74)专利代理 机构 南京众联专利代理有限公司 32206 专利代理师 王荷英 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01)C12N 15/11(2006.01) 审查员 刘东川 (54)发明名称 ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备 早期诊断和预后评估 食管癌的试剂盒中的应用 (57)摘要 本发明提供了ENO1基因启动子区甲基化位 点及其在制备早期诊断和预后评估食管癌的试 剂盒中的应用， 属于疾病诊断及预后评级技术领 域； ENO1基因启动子区甲基化位点如SEQ  ID  No.1所示， 提取食管鳞癌和癌旁正常样本组织 DNA， 经亚硫酸氢盐修饰后采用飞行质谱法检测 ENO1基因启动子区CpG位点的甲基化频率， 同时 采用免疫组化检测食管鳞癌和癌旁正常组织样 本中ENO1蛋白的表达； 研究发现食管鳞癌中EN O1 基因启动子区低甲基化且EN O1蛋白高表达， 且其 低甲基化的患者预后不良， ENO1可促进食管癌细 胞的糖酵解水平， 促进其增殖并抑制凋亡； 检测 ENO1基因的甲基化水平用于食管鳞癌的早期诊 断和预后评价的试剂。 权利要求书1页 说明书13页 序列表2页 附图7页 CN 114410797 B 2022.06.24 CN 114410797 B 1.一种用于扩增ENO1基因启动子区甲基化位点的引物对在制备早期诊断和/或预后评 估食管癌的试剂或试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述引物对为具有如SEQ  ID No.2 所示 的上游引物和具有如SEQ  ID No.3所示的下游引物。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述ENO1基因启动子区甲基化位点的甲基 化区域如SEQ  ID No.1所示，  所述ENO1基因启动子区甲基化位点为CpG_9.10.11位点， 所述 CpG_9.10.1 1位点的核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示。 3. 一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒， 其特征在于， 包括引物对， 所述 引物对为具有如SEQ  ID No.2 所示的上游引物和具有如SEQ  ID No.3所示的下游引物。 4.根据权利要求3所述的一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒， 其特征在 于， 检测ENO1基因启动子区甲基化位点甲基化水平的试剂为EZ ‑96 DNA Methylation ‑Gold ™。 5.根据权利要求3所述的一种用于食管癌的早期诊断和预后评价的试剂盒， 其特征在 于， 检测ENO1表达量的试剂为DNA  Methylati on‑Gold™。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410797 B 2ENO1基因启动子区甲 基化位点 及其在制备早期诊断和预后评 估食管癌的试剂盒中的应用 技术领域 [0001]本发明属于疾病诊断及预后评级技术领域， 具体涉及ENO1基因启动子区甲基化位 点及其在制备早期诊断和预后评估 食管癌的试剂盒中的应用。 背景技术 [0002]食管癌 （Esophageal  carcinoma， EC） 是全球致死相关癌症 中居第六位的肿 瘤。 食 管鳞状细胞癌 （Esophageal  squamous  cell carcinoma， ESCC） 是食管癌中最 常见的组织学 亚型， 特别是在东亚， 非洲东部和南部高发。 在中 国， 约 90％的食管癌患者 都为食管鳞状细 胞癌。 中国的食 管癌有明显的地域分布， 在河南、 河北、 江苏、 陕西、 山西、 福建等地居 各肿瘤 中的发病率居 首位。 尽管诊断和治疗方法有 所改善， 但由于早期淋巴结转移， 食 管鳞癌晚期 患者的生存率仍然很低， 其患者5年生存率仍较低。 根据病因学和流行病 学研究表明， 食管 癌的发生是多种因素共同发挥效应而导致的疾病。 因此， 当下寻找导致食管癌的致病因素 和发病机制尤为重要。 [0003]烯醇化酶  1 （ENO1） 作为糖酵解中的关键酶， 可以催化  2‑磷酸甘油酸形成磷酸烯 醇丙酮酸。 ENO1除行使糖酵解中的催化功能外， 还在许多转移 性肿瘤中发挥重要作用。 已有 研究报道ENO1可以影响肿 瘤细胞的增殖、 细胞凋亡、 侵袭和转移等生物学行为。 例如， 在结 肠癌中， ENO1可以通过调节AMPK/mTOR通路促进结肠癌的增殖、 侵袭和迁移能力。 此外， 沉默 ENO1 的表达可通过抑制  PI3K/ Akt途径抑制神经胶质瘤细胞的生长， 迁移和侵袭。 在结直 肠癌中， FBXW7通过蛋白酶体途径来促进ENO1的泛素化水平降解， 以降低肿瘤的糖酵解水 平， 最终抑制肿瘤 细胞的迁移和侵 袭。 另有研究报道ENO1高表达的患者总体生存率降低。 [0004]食管癌的发生是由环境和遗传因素共同作用引起的。 DNA甲基化是人类基因组的 主要表观遗传形式。 在大多数类型的癌症中， DNA甲基化通常存在异常。 甲基化是基因组   DNA中胞嘧啶的共价修饰， 主要发生在脊椎动物的CpG二核苷酸中， 并且通常与长期转录抑 制相关。 通过检索相关文献， 发现在食管癌中， P16、 RASSF1A基因的启动子区域均存在高甲 基化状态， 高甲基化抑制基因的表达， 从而促进癌症的发展。 申请人前期研究发现， 食管鳞 癌组织中miR ‑203和miR ‑34a甲基化水平明显高于癌旁正常组织， 且它们的高甲基化和表达 水平具有显著相关性， 经分析还发现其高甲基化水平与淋巴结转移显著相关， 表明其高甲 基化水平促进食管鳞癌的发展。 还发现， PLCE1基因启动子区低甲基化调控其蛋白高表达， 并通过NFκB通路和VEGF ‑C/Bcl‑2的表达促进食管鳞癌细胞的血管生成和增殖。 因此， 探索 食管癌中基因的 甲基化对于 ESCC的早期诊断， 精确预后和个 体化治疗具有重要意 义。 发明内容 [0005]为解决上述问题， 本发明公开了一种ENO1基因启动子区甲基化位点及其在制备早 期诊断和预后评估 食管癌的试剂盒中的应用。 [0006]为达到上述目的， 本发明的技 术方案如下：说　明　书 1/13 页 3 CN 114410797 B 3