(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202280002592.3 (22)申请日 2022.03.30 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2022.08.10 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/CN2022/083950 2022.03.30 (71)申请人 中国医学 科学院药用植物研究所 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路151 号 (72)发明人 宋经元　齐桂红　许文杰　郝利军　 甘雨桐　辛天怡　 (74)专利代理 机构 北京信慧永光知识产权代理 有限责任公司 1 1290 专利代理师 董世豪　张淑珍(51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 基于全基因组分析的真核生物物种鉴定方 法及应用 (57)摘要 本申请公开了一种基于全基因组分析的真 核生物样品的物种鉴定方法及其应用， 其中， 通 过筛选得到的物种特异性靶 标序列， 实现了对待 检测样品的物种鉴定。 本发明的物种鉴定方法特 异性强， 灵敏度高， 重复性好， 可不需要依靠 大型 专业仪器来实现物种的快速鉴定， 因此， 具有广 阔的应用前 景。 权利要求书3页 说明书12页 序列表4页 附图3页 CN 115087750 A 2022.09.20 CN 115087750 A 1.一种基于全基因 组分析的真核生物 物种鉴定方法， 包括： i)基于待鉴定物种的全基因 组序列， 构建小片段基因 组文库； ii)基于iv)中的检测的要求或根据全基因组注释文件和数据库收录的物种序列信息， 选择性地对所述小片段基因 组文库中的序列进行筛 选， 获得广泛候选靶标序列 库； iii)基于所述待鉴定物种的近缘物种的全基因组序列， 将所述小片段基因组文库或所 述广泛候选靶标序列库中的序列与所述近缘物种的全基因组序列进行比对， 选择仅存在于 所述待鉴定物种中的序列来构建特异性靶标序列 库； iv)获得待检测的真核生物样品的基因组DNA并基于所述特异性靶标序列库中的序列 对所述真核生物样品进行物种鉴定， 对所述基因组DNA检测是否含有所述特异性靶标序列 库中的序列， 从而确定所述真核生物样品与所述待鉴定物种的同一 性。 2.如权利要求1所述的方法， 在i)中， 将所述待鉴定物种的全基因组序列分成(L ‑K+1) 个长度为K的片段以构建所述小片段基因组文库， 并计算其中的每个片段的拷贝 数， 再通过 将各片段与所述全基因组序列比对确定每个片段的基因组位置， 其中L表示全基因组序列 长度， K表示所述文库中的片段长度。 3.如权利要求1或2所述的方法， 在i)中， 所述待鉴定物种来自动物、 植物或真菌 。 4.如权利要求1或2所述的方法， 在ii)中， 对所述小片段基因组文库中的每一个片段检 测PAM基序， 并提取 带有PAM的序列构建所述广泛候选靶标序列 库。 5.如权利要求4所述的方法， 其中， 所述PAM是5'端带有如SEQ  ID NO:10所示的氨基酸 序列或3'端带有如SEQ  ID NO:11所示的氨基酸序列的PAM 。 6.如权利要求1或2所述的方法， 在iii)中， 在种内保守性高且种间差异性大区域内选 择仅存在于所述待鉴定物种中的序列来构建所述特异性靶标序列 库。 7.如权利要求6所述的方法， 其中， 所述仅存在于所述待鉴定物种中的序列为与所述近 缘物种的全基因 组序列存在至少n个碱基差异的候选靶标序列， 其中n大于等于 3。 8.如权利要求1或2所述的方法， 在iii)中， 选择仅存在于所述待鉴定物种中的多个不 同的序列来构建所述特异性靶标序列 库。 9.如权利要求1或2所述的方法， 在iv)中， 所述待检测的真核生物样品是来自动物、 植 物或真菌的样品。 10.如权利要求9所述的方法， 其中， 所述待检测的真核生物生物样品是单一物种来源 的样品或者是多种物种来源的样品的混合物。 11.如权利要求10所述的方法， 其中， 所述待检测的真核生物样品是来自冬虫夏草、 蛹 虫草、 药用大黄、 掌叶大黄、 马鹿或驯鹿的样品。 12.如权利要求1或2所述的方法， 在iv)中， 采用基因编辑系统或测序进行 所述检测。 13.如权利要求12所述的方法， 在iv)中， 采用具有荧光信号分子 的CRISPR/Cas系统进 行所述检测。 14.如权利要求12所述的方法， 在iv)中， 进行所述检测之前， 基于用于所述检测的技 术， 预先构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库。 15.如权利要求14所述的方法， 在iv)中， 采用基因组编辑系统进行所述检测， 预先构建 与所述特异性靶标序列相匹配的crRNA和任选的t racr RNA的工具库。 16.如权利要求14所述的方法， 在iv)中， 采用测序进行所述检测， 预先构建与所述特异权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115087750 A 2性靶标序列相匹配的引物对的工具库。 17.如权利 要求1或2所述的方法， 其中， 所述待鉴定物种为冬虫夏草， 在iii)中， 所述特 异性靶标序列为如SEQ  ID NO:1所示的核苷酸序列。 18.如权利 要求1或2所述的方法， 其中， 所述待鉴定物种为药用大黄， 在iii)中， 所述特 异性靶标序列为如SEQ  ID NO:2所示的核苷酸序列。 19.如权利 要求1或2所述的方法， 其中， 所述待鉴定物种为马鹿， 在iii)中， 所述特异性 靶标序列为如SEQ  ID NO:3所示的核苷酸序列。 20.如权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述待鉴定物种为冬虫夏草， 在iv)中， 采用如 下引物对进行 所述检测： ITS4F： 5' ‑GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG‑3'(SEQ ID NO:4)； ITS5R： 5' ‑TCCTCCGCTTATTGATATGC ‑3'(SEQ ID NO:5)。 21.如权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述待鉴定物种为药用大黄， 在iv)中， 采用如 下引物对进行 所述检测： Ro_1F:5’ ‑CCAAATTGCCCGAAGCCTATG‑3’(SEQ ID NO:6)； Ro_1R： 5’ ‑ATCGCTTTCCGACCCACAAT‑3’(SEQ ID NO:7)。 22.如权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述待鉴定物种为马鹿， 在iv)中， 采用如下引 物对进行 所述检测： Ce_17F： 5’ ‑A*G*CAGAAGTGATGGTTGCT*G*‑3’(SEQ ID NO:8)； Ce_17R： 5 ’ ‑A*A*GAATCCTAGGAAGAACTGG*T*‑3’(SEQ ID NO:9)。 23.一种构建用于真核生物 物种鉴定的特异性靶标序列 库的方法， 包括： a)选择待鉴定物种， 按照权利 要求1‑16中任一项所述的物种鉴定方法筛选得到所述待 鉴定物种的1个或多个特异性靶标序列； b)将所述待鉴定物种的1个或多个特异性靶标序列组合， 构建所述特异性靶标序列 库。 24.一种构建用于对真核生物物种鉴定的特异性靶标序列进行检测的工具库的方法， 包括： A)选择待鉴定物种， 按照权利要求23所述的方法构建特异性靶标序列 库； B)基于用于所述检测的技 术， 构建与所述特异性靶标序列相匹配的工具库。 25.如权利要求24所述的方法， 其中， 用于所述检测的技 术为基因编辑或测序。 26.如权利要求25所述的方法， 其中， 所述工具库为crRNA库或引物库。 27.一种区分中药 材与其相应混伪品的方法， 包括： I)将所述中药材或混伪品用作待鉴定物种， 按照 权利要求1 ‑16中任一项所述的方法筛 选得到特异性靶标序列； II)获得待检测的药材样品的基因组DNA， 并检测所述基因组DNA中是否含有所述特异 性靶标序列， 从而确定所述待检测的药 材样品与所述中药 材或混伪品的同一 性。 28.一种用于食品、 药品或保健品的安全检测的方法， 包括： 1)将食品用真核生物、 药品用真核生物或保健品用真核生物用作待鉴定物种， 按照权 利要求1‑16中任一项所述的方法筛 选得到特异性靶标序列； 2)获得待检测的食品、 药品或保健品的基因组DNA， 并检测所述基因组DNA中是否含有 所述特异性靶标序列， 从而确定所述待检测的食品、 药品或保健品与所述待鉴定物种的同权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115087750 A 3