(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210330415.X (22)申请日 2022.03.30 (71)申请人 海南大学 地址 570000 海南省海口市人民大道58号 (72)发明人 房传营　郭志宇　王玉慧　王瑞　 李名扬　 (74)专利代理 机构 苏州中合知识产权代理事务 所(普通合伙) 32266 专利代理师 刘召民 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒 及方法 (57)摘要 本发明提供了快速检测百香果西番莲斑驳 病毒的试剂盒， 包括PaMV引物， 所述PaMV引物的 序 列 为 ： P a M V ‑F 5′ ‑ cagaatgcacaactcaacgagttgcagcagta ‑3′， PaMV‑ R 5′ ‑gcttgtagtccaatagatggtccaaatccaag ‑3′。 本发明提供了快速检测百香果西番莲斑驳病毒 的试剂盒及方法， 可 以在田间实现短时、 准确的 批量检测PaMV病毒。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114934134 A 2022.08.23 CN 114934134 A 1.快速检测百香 果西番莲斑驳病毒的试剂盒， 包括PaMV引物， 所述PaMV引物的序列为： PaMV‑F 5′ ‑cagaatgcacaactcaacgagttgcagcagta‑3′， PaMV‑R 5′ ‑gcttgtagtccaatagatggtccaaatccaag‑3′。 2.根据权利要求1所述的快速检测百香果西番莲斑驳病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 还包 括PaMV探针， 所述PaMV探针的序列不与特异性引物识别 位点重叠， 长度为46 ‑52nt， 序列避 免回文序列、 内部二级结构和连续的重复碱基； 探针共有四个修饰位点： 距离5 ′端的≥35nt 的中部位置标记一个dSpacer  THF， 作为核酸外切酶 的识别位点； THF位点的上游标记一个 荧光基团， 下游标记一个淬灭基团， 两个基团的间距为2 ‑4nt； THF距离3 ′末端≥15nt， 并且 3′末端标记一个修饰 基团。 3.根据权利要求2所述的快速检测百香果西番莲斑驳病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述 修饰基团选自胺基、 磷酸基团或C 3‑Spacer。 4.根据权利要求2所述的快速检测百香果西番莲斑驳病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述 PaMV探针的序列为： aactatcaggacggatgcaatgag[FAM‑dT]c[THF]g[BHQ1 ‑dT]atcactc caatc[C3‑spacer]。 5.快速检测百香 果西番莲斑驳病毒的方法， 包括： 1)向反应管中加入上游引物、 下游引物、 探针、 RNase ‑free水、 核酸模板和缓冲液； 上游引物的序列为： 5 ′ ‑cagaatgcacaactcaacgagttgcagcagta‑3′， 下游引物的序列为： 5 ′ ‑gcttgtagtccaatagatggtccaaatccaag‑3′， 探针序列为： aactatcaggacggatgcaatgag[FAM‑dT]c[THF]g[BHQ1 ‑dT]atcactc caatc[C3‑spacer]； 2)混匀后， 将反应液甩至管子底部， 然后立即将反应管放入恒温设备中， 恒温42℃， 反 应时间30min； 3)将反应后的产物至于荧光检测仪中。 在阴性对照呈现无荧光， 阳性对照呈现荧光的 情况下， 若样 品呈现荧光， 说明此样品存在PaMV病毒的感染； 若样品无荧光， 说明此样品不 存在PaMV病毒的感染。 6.根据权利要求5所述的快速检测百香果西番莲斑驳病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1) 中通过以下方法获取核酸模板： 取5 ‑10g百香果新鲜的嫩叶置于1.5mL的离心管中， 加入15 ‑ 25 μL RNase free水， 用研磨棒将其研磨至匀浆状， 吸取2 μL至新的离心管中并稀释至50 μL 作为核酸模板使用。 7.根据权利要求5所述的快速检测百香果西番莲斑驳病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1) 每10 μL反应体系中， 加入0.4 μL上游引物、 0.4 μL下游引物、 0.24 μL探针、 2.08 μL  RNase‑free 水、 0.5 μL核酸模板和6.38 μL缓冲液。 8.根据权利要求5所述的快速检测百香果西番莲斑驳病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1) 中引物和探针浓度分别为10 μM和5 μM 。 9.根据权利要求5 ‑8任意一项所述的快速检测百香果西番莲斑驳病毒的方法， 其特征 在于， 步骤3)中阴性对照的模板为RNase ‑free水， 阳性对照的模板为PaMV质粒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934134 A 2快速检测百 香果西番莲斑驳病毒 的试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于植物病毒检测技术领域， 涉及快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂 盒及方法。 背景技术 [0002]百香果作为一种重要的经济作物， 其加工产业包括饮料、 果粉等衍生产品的利润 较为丰厚， 因此有大量农户种植百香果。 但在种植百香果的过程中， 病毒病很常见， 给果农 造成了很大的损失。 毫不夸张的说， 凡是有 百香果种植的区域， 基本上都有百香果病毒病的 发生。 [0003]西番莲斑驳病毒(Passiflor a mottle virus， PaMV)是影响百香果产量的病毒病 之一。 其主要的传播途径依靠带病苗、 机械传播、 嫁接传播及棉蚜、 绣线菊蚜等， 与其他病毒 病一样， 由病毒病的侵染而引起的作物减产是农业生产中的一个持久性问题， 为了最大限 度地减少病毒造成的损害， 确保农业的可持续发展， 探寻快速而精准的检测方法对控制这 些植物病毒至关重要。 [0004]随着贸易全球化的发展， 加剧了病毒及其宿主和载体的转移， 这使得植物病毒检 测技术变得更加重要。 近年来， 植物病毒检测技术 发展很快， 多种多样。 包括生物学方法、 血 清学方法、 电镜观察方法以及分子生物学方法中的核酸分子杂交技术、 双链RNA电泳技术、 聚合酶链式反应技术(PCR， RT ‑PCR， 实时荧光定量PCR， 多重PCR， 巢式PCR)、 核酸序列扩增技 术、 环介导等温扩增技术等。 这些方法通常不够快速和简便， 不能满足农户快速、 批量检测 的要求。 发明内容 [0005]针对上述问题， 本发明提供了快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒及方法， 可以在田间实现短时、 准确的批量检测PaMV病毒。 [0006]为了实现本发明的技 术目的， 本发明采用的技 术方案为： [0007]本发明提供了快速检测百香果西番莲斑驳病毒的试剂盒， 包括PaMV引物， 所述 PaMV引物的序列为： [0008]PaMV‑F 5′ ‑cagaatgcacaactcaacgagttgcagcagta‑3′， [0009]PaMV‑R 5′ ‑gcttgtagtccaatagatggtccaaatccaag‑3′。 [0010]优选地， 还包括PaMV探针， 所述PaMV探针的序列不与特异性引物识别位点重叠， 长 度为46‑52nt， 序列避免回文序列、 内部二级结构和连续的重复碱基； 探针共有四个修饰位 点： 距离5 ′端的≥35nt的中部位置标记一个dSpacer  THF， 作为核酸外切酶的识别位点； THF 位点的上游标记 一个荧光基团， 下游标记 一个淬灭基团， 两个基团的间距 为2‑4nt； THF距离 3′末端≥15nt， 并且3 ′末端标记一个修饰 基团。 [0011]更优选地， 所述 修饰基团选自胺基、 磷酸基团或C 3‑Spacer。 [0012]优选地， 所述PaMV探针的序列为：说　明　书 1/4 页 3 CN 114934134 A 3