(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210329056.6 (22)申请日 2022.03.30 (71)申请人 海南大学 地址 570000 海南省海口市人民大道58号 (72)发明人 李康　王玉慧　郭志宇　李名扬　 王瑞　 (74)专利代理 机构 苏州中合知识产权代理事务 所(普通合伙) 32266 专利代理师 刘召民 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及 方法 (57)摘要 本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病 毒的试剂盒及方法， 试剂盒包括CMV引物， 所述 C M V 引 物 的 序 列 为 ：C M V ‑F ：5′‑ cggtattgaacgctgcgttattcacgctgg ‑3′， CMV‑R： 5′ ‑ctaggataaccttgaattgctccatccacgc ‑3′。 本 发明可以在田间实现短时、 准确的批量检测CMV 病毒， 操作方法简单易行， 具有灵敏度高、 特异性 强、 反应时间短等特点， 可以实现常温操作， 常温 反应以及常温保存， 非常适合田间大规模快速检 测。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114941040 A 2022.08.26 CN 114941040 A 1.快速检测百香 果黄瓜花叶病毒的试剂盒， 包括C MV引物， 所述C MV引物的序列为： CMV‑F 5′ ‑cggtattgaacgctgcgt tattcacgctg g‑3′， CMV‑R 5′ ‑ctaggataaccttgaattgctccatccacgc‑3′。 2.根据权利要求1所述的快速检测百香果黄瓜花叶病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 还包括 CMV探针， 所述CMV探针的序列不与特异性引物识别位点重叠， 长度为46 ‑52nt， 序列避免回 文序列、 内部二级结构和连续的重复碱基； 所述CMV探针共有四个修饰位点： 距离5 ′端的≥ 35nt的中部位置标记一个dSpacer  THF， 作为核酸外切酶 的识别位点； THF位点的上游标记 一个荧光基团， 下游标记一个淬灭基团， 两个基团的间距为2 ‑4nt； THF距离3 ′末端≥15nt， 并且3′末端标记一个修饰 基团。 3.根据权利要求2所述的快速检测百香果黄瓜花叶病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述修 饰基团选自胺基、 磷酸基团或C 3‑Spacer。 4.根据权利要求2或3所述的快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒， 其特征在于， 所 述CMV探针的序列为tacctgggatgtgcccacccgaac[FAM ‑dT]c[THF][BHQ1 ‑dT] tcgacattgtattt[C3‑spacer]。 5.快速检测百香 果黄瓜花叶病毒的方法， 包括： 1)向反应管中加入上游引物、 下游引物、 探针、 RNase ‑free水、 核酸模板和缓冲液； 上游引物的序列为： 5 ′ ‑cggtattgaacgctgcgt tattcacgctg g‑3′， 下游引物的序列为： 5 ′ ‑ctaggataaccttgaattgctccatccacgc‑3′， 探针序列为： tacctgggatgtgcccacccgaac[FAM‑dT]c[THF][BHQ1 ‑dT]tcgacattgtattt[C3‑spacer]； 2)混匀后， 将反应液甩至管子底部， 然后立即将反应管放入恒温设备中， 恒温42℃， 反 应时间30min； 3)将反应后的产物至于荧光检测仪中， 在阴性对照呈现无荧光， 阳性对照呈现荧光的 情况下， 若样品呈现荧光， 说明此样品存在CMV病毒的感染； 若样品无荧光， 说明此样品不存 在CMV病毒的感染。 6.根据权利要求5所述的快速检测百香果黄瓜花叶病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1)中 通过以下方法获取核酸模板： 取5 ‑10g百香果新鲜的嫩叶置于1.5mL的离心管中， 加入15 ‑25 μL RNase free水， 用研磨棒将其研磨至匀浆状， 吸取2 μL至新的离心管中并稀释至50 μL作 为核酸模板使用。 7.根据权利要求5所述的快速检测百香果黄瓜花叶病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1)每 10μL反应体系中， 加入0.4μL上游引物、 0.4μL下游引物、 0.24μL探针、 2.08 μL  RNase‑free 水、 0.5 μL核酸模板和6.38 μL缓冲液。 8.根据权利要求5所述的快速检测百香果黄瓜花叶病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1)中 引物和探针浓度分别为10 μM和5 μM 。 9.根据权利要求5 ‑8任意一项所述的快速检测百香果黄瓜花叶病毒的方法， 其特征在 于， 步骤3)中阴性对照的模板为RNase ‑free水， 阳性对照的模板为C MV质粒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114941040 A 2快速检测百 香果黄瓜花叶病毒 的试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明属于植物病毒检测技术领域， 涉及快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒 及方法。 背景技术 [0002]黄瓜花叶病毒(Cucumber  mosaic virus， CMV)是寄主 范围最多、 分布最广、 最具经 济重要性的植物病毒之一。 黄瓜花叶病毒(CMV)是一种植物病毒， 它能攻击包括百香果在内 的多种植物， 就可能感染的物种而言， 它 是分布最广的植物病毒。 它主要通过蚜虫传播， 有 时通过种子传播。 与所有植物病毒一样， 对感染的植物没有治疗方法。 对付这种病毒的最好 办法是培育抗病品种并根除受感染的作 物以防止传播， 所以开发出一种能够实现田间快速 检测该病毒的方法成为了 重中之重 。 [0003]百香果CMV病毒病发病时叶片带浅黄色斑驳， 病叶皱缩， 严重时叶片反卷。 部分果 实畸形硬化， 果肉少或无， 植株生长不良， 产量低， 品质差。 它的可怕之处在于目前无法通过 药物治愈， 植株显症后不是直接销毁， 就是收果后缓期销毁， 因为植株发病后打药成本会不 断增加， 产量和品质却越来越差， 严重影响果农收益。 发明内容 [0004]针对上述问题， 本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒及方法， 利 用RNA恒温快速扩增荧 光型试剂盒(MIRA)可以在田间实现短时、 准确的批量检测C MV病毒。 [0005]为了实现本发明的技 术目的， 本发明采用的技 术方案为： [0006]本发明提供了快速检测百香果黄瓜花叶病毒的试剂盒， 包括CMV引物， 所述CMV引 物的序列为： [0007]CMV‑F 5′ ‑cggtattgaacgctgcgt tattcacgctg g‑3′， [0008]CMV‑R 5′ ‑ctaggataaccttgaattgctccatccacgc‑3′。 [0009]优选地， 还包括CMV探针， 所述CMV探针的序列不与特异性引物识别位点重叠， 长度 为46‑52nt， 序列避免回文序列、 内部二级结构和连续的重复碱基； 所述CMV探针共有四个修 饰位点： 距离5 ′端的≥35nt 的中部位置标记一个dSpacer  THF， 作为核酸外切酶的识别位 点； THF位点的上游标记一个荧光基团， 下游标记一个淬灭基团， 两个基团的间距为2 ‑4nt； THF距离3′末端≥15nt， 并且3 ′末端标记一个修饰 基团。 [0010]更优选地， 所述 修饰基团选自胺基、 磷酸基团或C 3‑Spacer。 [0011]优选地， 所述CMV探针的序列为tacctgggatgtgcccacccgaac[FAM ‑dT]c[THF] [BHQ1‑dT]tcgacattgtattt[C3‑spacer]。 [0012]本发明还提供了快速检测百香 果黄瓜花叶病毒的方法， 包括： [0013]1)向反应管中加入上游引物、 下游引物、 探针、 RNase ‑free水、 核酸模板和缓冲液； [0014]上游引物的序列为： 5 ′ ‑cggtattgaacgctgcgt tattcacgctg g‑3′， [0015]下游引物的序列为： 5 ′ ‑ctaggataaccttgaattgctccatccacgc‑3′，说　明　书 1/4 页 3 CN 114941040 A 3