(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210330457.3 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风 华路 818号 (72)发明人 宋雪梅　曹宇浩　竺亚斌　赵枫　 庞倩　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 高宁馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与皮肤 修复相关的miRNA组合及其应用 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 具体公开了一种 与皮肤修复相关的miRNA组合及其应用， 本发明 开发了基于实时定量PCR技术的组织miRNA的两 步法检测试剂、 试剂盒和检测方法。 本发明所述 miRNA包括miR ‑21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑ 5p中的一种或多种。 所述试剂盒含有检测上述 miRNA的探针组合， 本发明所述 miRNA可作为 皮肤 修复过程研究及相关药物筛选的标志物， 或皮肤 炎症和细胞凋亡相关的标志物。 本发 明提供的检 测试剂盒和检测方法具有使用样 本量小， 自动化 程度高， 特异性好的优点， 结合其他检测指标和 临床症状， 可显著提高检测 效率， 便于皮肤外伤 修复药物的批量筛 选及临床检测使用。 权利要求书2页 说明书11页 附图6页 CN 114875129 A 2022.08.09 CN 114875129 A 1.miRNA分子作为标志物在皮肤修复过程研究中的应用， 其特征在于： 所述miRNA分子 为miR‑21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑5p中的一种或多种。 2.miRNA分子作为靶标在皮肤修复相关药物筛选中的应用， 其特征在于： 所述miRNA分 子为miR‑21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑5p中的一种或多种。 3.miRNA分子作为皮肤炎症和细胞凋亡标志物的应用， 其特征在于： 所述miRNA分子为 miR‑21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑5p中的一种或多种。 4.miRNA分子在制备皮肤修复过程研究用试剂、 皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂中的应 用， 其特征在于： 所述miRNA分子为miR ‑21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑5p中的一种或多种。 5.miRNA分子在制备皮肤修复过程研究用试剂盒、 皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂盒中 的应用， 其特征在于： 所述miRNA分子为miR ‑21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑5p中的一种或 多种。 6.根据权利要4或权利要求5所述的应用， 所述试剂/试剂盒为基于PCR平台miRNA两步 法检测试剂/试剂盒。 7.根据权利 要4或权利要求5所述的应用， 所述试剂/试剂盒包括miRNA分子特异性茎环 结构转录引物、 看家基因U6转录引物、 探针序列、 PCR正向引物引物、 PCR反向引物、 PCR通用 下游引物； 其中， miR‑21a‑5p对应的转录引物如SEQ  ID NO.5所示， miR ‑21a‑5pPCR正向引物序列如SEQ   ID NO.6所示， miR ‑21a‑5p探针序列如SEQ  ID NO.7所示； miR‑223‑3p对应的转录引物为如SEQ  ID NO.8所示， miR ‑223‑3p PCR正向引物序列如 SEQ ID NO.9所示， miR ‑223‑3p探针序列如SEQ  ID NO.10所示； miR‑669a‑5p对应的转录引物如SEQ  ID NO.11所示， miR ‑669a‑5pPCR正向引物序列为 如SEQ ID NO.12所示， miR ‑669a‑5p探针序列为如SEQ  ID NO.13所示， miRNA分子miR ‑21a‑5p 、 miR‑223‑3p和miR‑669a‑5p的PCR反向引物序列为miRNA  PCR 通用下游引物， 所述miRNA  PCR通用下游引物序列如SEQ  ID NO.14所示； 看家基因U6对应的转录引物如SEQ  ID NO.15所示， 看家基因U6  PCR正向引物序列如如 SEQ ID NO.16所示， 看家基因U6探针序列如SEQ  ID NO.17所示， 看家基因U6  PCR反向引物 序列如SEQ  ID NO.18所示。 8.根据权利要求1 ‑7任一所述的应用， 其特 征在于： 所述miR‑21a‑5p的序列为UAGCU UAUCAGACUGAUGU UGA （SEQ ID NO.1） ； 所述miR‑223‑3p的序列为UGUCAGU UUGUCAAAUACCCCA （SEQ ID NO.2） ； 所述miR‑669a‑5p的序列为AGU UGUGUGUGCAUGU UCAUGUCU （SEQ  ID NO.3） 。 9.根据权利要4所述的试剂或权利要求5所示的试剂盒的使用方法， 其特征在于： 所述 miRNA分子为miR ‑21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑5p中的一种或多种； 所述使用方法包括： （1） 皮肤总RNA提取； （2） cDNA合成； （3） 荧光定量PCR检测分析： 每个cDNA样品设置3个重复， 加样至96孔板的PCR反应板中， 按照两步法进行扩增， 同时以等体积的ddH2O代替cDNA进行阴性对照样本的荧光定量PCR扩 增； 荧光定量PCR反应程序为9 5℃预变性2  min； 95℃变性10  sec， 60℃延伸/退火2 0 sec， 共 40个循环。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875129 A 210.一种基于miRNA双通道检测体系， 其特征在于： 所述体系包含miRNA分子标志物miR ‑ 21a‑5p、 miR‑223‑3p、 miR‑669a‑5p； FAM及HEX标记的分子杂交探针； miRNA分子标志物特异 性茎环结构转录引物、 PCR正向引物引物、 PCR通用下游引物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875129 A 3