(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210352684.6 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 杭州丹威 生物科技有限公司 地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街 道余杭塘路2959号4幢2层、 6层601、 9 层902、 1幢2层 (72)发明人 刘松林　赵丹蕊　郭兴中　陈文　 秦泽倩　倪佳润　 (74)专利代理 机构 杭州君锐知产专利代理事务 所(普通合伙) 33443 专利代理师 方琦 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 免提取核酸检测人乳头瘤病毒的引物探针 组、 检测试剂及其应用 (57)摘要 本发明涉及分子生物 技术领域， 具体涉及一 种免提取核酸检测人乳头瘤病毒的引物探针组、 检测试剂及其应用。 本发明的免提取核酸检测人 乳头瘤病毒的引物探针组具有高灵敏度、 高特异 性， 能有效的检出14种不同型别的人乳头瘤病 毒。 本发明的含有所述引物探针组的检测试剂， 用于人乳头瘤病毒免提取核酸检测方法， 以解决 现有检测技术中存在的样本处理繁琐、 对核酸纯 度要求高、 PCR检测时间偏长等 缺点。 权利要求书1页 说明书13页 序列表5页 附图6页 CN 114891923 A 2022.08.12 CN 114891923 A 1.一种免提取核酸检测人乳头瘤病毒的引物探针组， 其特征在于： 所述免提取核酸检 测人乳头瘤病毒的引物探针组包括 用于扩增14  种HPV高危亚型人乳头瘤病毒的HPV通用型引物， 如SEQ  ID No .1~7所示 的核苷酸序列； 14  种HPV高危亚型人乳头瘤病毒是HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 66、 68； 分别特异性检测13种HPV高危亚型人乳头瘤病毒HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 66 的HPV特异性探针， 如SEQ  ID No .8~20所示的核苷酸序列， 分别特异性检测 HPV68a、 HPV68b的HPV特异性探针， 如SEQ  ID No .21~22所示的核苷酸序列， 扩增并检测内标基因的特异性引物对和探针， 如SEQ  ID No .23~25所示的核苷酸序 列。 2.一种免提取核酸检测人乳头瘤病毒的检测试剂， 其特征在于： 所述的检测试剂包括 用于对采集的样本进行保存的样本保存液和用于对样本实时荧 光PCR检测的荧 光PCR试剂， 样本保存液包 含： 终浓度1 ‑15 μg/mL的Car rier RNA和终浓度5 ‑30 mM的TCEP； 所述荧光PCR试剂包含： 权利要求1所述的引物探针组， 终浓度1 ‑15 μg/mL的Carrier   RNA （核苷酸类似物） ， 和终浓度0.1 ‑0.15 M的 tris （三羟甲基氨基甲烷） 。 3.根据权利要求2所述的检测试剂， 其特征在于： 所述荧光PCR试剂还包含： 终浓度 0.01%‑0.1% （wt） 的吐温 ‑20， 和终浓度0.1 ‑5 mM的TCEP。 4.一种含有权利要求2所述的检测试剂的免提取核酸检测人乳头瘤病毒的检测试剂 盒。 5.一种非诊断或治疗目的人乳头瘤病 毒免提取核酸检测方法， 其特征在于该方法包括 如下步骤： S1、 样本保存液的制备： 样本保存液包含： 终浓度1 ‑15 μg/mL的Carrier  RNA和终浓度 5‑30 mM的TCEP； S2、 采样及 保存： 利用一次性宫颈采样刷采集HPV样本至包含样本保存液的样本保存管 中； S3、 细胞富 集， 吸取样本转移至样本保存管中， 静置 5‑15min； S4、 配制荧光PCR试剂， 所述荧光PCR试剂包含： 权利要求1所述的引物探针组， 终浓度1 ‑ 15 μg/mL的Car rier RNA， 和终浓度0.1 ‑0.15 M的 tris； S5、 实时荧光PCR检测， 从样本保存管中吸取样本， 加入荧光PCR试剂中， 混匀封盖后放 入PCR仪中， 设置反应程序， 进行荧 光PCR检测。 6.根据权利要求5所述的人乳头瘤病毒免提取核酸检测方法， 其特征在于： 所述荧光 PCR试剂还 包含： 终浓度0.01% ‑0.1% （wt） 的吐温 ‑20， 和终浓度0.1 ‑5 mM的TCEP。 7.根据权利要求5所述的人乳头瘤病 毒免提取核酸检测方法， 其特征在于： 步骤S3所述 样本保存管 具有 “V”型底部， V ”型底部夹角≤30°。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891923 A 2免提取核酸检测人乳头瘤病毒 的引物探针组、 检测试剂及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物技术领域， 具体涉及 一种免提取核酸检测人乳头瘤病毒的引 物探针组、 检测试剂及其应用。 背景技术 [0002]根据基因片断序列的多态性分型， 目前已发现HPV基因型达200多型， 根据其与宫 颈癌发生的联系程度， HPV可分为低危型和高危型。 高危型HPV病毒可引起子宫颈上皮内瘤 变甚至发展到宫颈癌。 公认的高危型HPV有16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 68、 73 型和82型等， 其中约70％的宫颈癌患者可检测到HPV16、 18。 据 2003‑2004年来自美国的国家 健康和营养研究课题的对女性生殖道感染HPV调查结果显示14 ‑59岁的HPV总感染率为 26.8％， 所以HPV感染在女性造成的负担超出之前的估计。 我国每年约有13.15万新发现的 宫颈癌， 报告中发病率和死亡率有增加趋势， 且宫颈癌发病年龄年轻化， 可以预见HPV感染 造成在我国造成的损失的巨大。 大多数HPV感染的女性无 临床症状， 并且在2 年内自然消退， 只有小部分将持续感染并最终导致宫颈上皮内瘤变甚至宫颈癌， 所以持续高危型HPV感染 是宫颈癌前病变及宫颈癌发生的必要条件， 因此， HPV检测是宫颈癌筛查的基础项目之一。 [0003]人乳头瘤状病毒(human  papillomavims， HPV)是一种微小双链DNA病毒， 包含 7500‑8000碱基对， 主要分上游调控区(LCR)、 早期转录区(E)、 晚期转录区(L)等3个区域， 其 中LCR含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV基因表达所必需的调控 元件， 调控病毒的转录与 复制， E区按顺序为E6、 E7、 E1、 E2、 E3、 E4和E5共7个基因， 具有参与病毒DNA的复制、 转录、 翻 译、 调控和细胞转化等功能， L区主要有衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2， 其功能是编码病毒 的衣壳蛋白。 [0004]鉴于HPV至今尚不能在体外培养， 现有临床检测手段主要依赖于HPV病毒分子检 测， 包含杂交捕获法、 PCR ‑反向杂交法、 荧光PCR法等方法。 荧光PCR法利用特异性引物和探 针识别靶基因序列， 通过扩增 基因片段， 上亿倍放大病毒载量， 能有效的提高检测灵敏度。 采用特异性TaqMan探针检测， 对HPV型进行分型检测， 特异 性好， 不易交叉反应， 并对样 本和 人员要求 不高， 检测时间短。 [0005]实时荧光PC R法的检测灵敏度高于其他检测手段， 但现行的实时荧光PC R在敏感度 仍然存在不足的问题， 主要是部分样本使用磁珠法或离心柱法提取样本总核酸(或病毒核 酸)后， 检测结果处于阳性和阴性之间的 “灰区”， 甚至部分样本当其检测呈阴性结果时， 仍 不能排除病人未感染病毒。 主要是荧光PCR法对样本进行核酸提取， 在样本的提取过程中， 容易出现交叉污染， 且提取产 物残留的乙醇及盐酸胍对P CR造成抑制， 争对现有的样 本处理 方法易造成漏检及假阳性， 因此研究一种免提取 的样本处理方式及装置， 能有效富集更多 的病毒， 并直接扩增临床样 本的检测试剂及方法， 不仅能大大缩短样 本处理时间， 降低检测 成本， 并保证更好的特异性及灵敏度， 对HPV的普查和宫颈癌的防治具有重大现实意 义。说　明　书 1/13 页 3 CN 114891923 A 3