(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210331791.0 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 湖北省烟草科学研究院 地址 430000 湖北省武汉市硚口区宝丰二 路6号香溢大酒店 (72)发明人 许汝冰　李锡宏　黎妍妍　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 徐瑛 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) A01N 63/60(2020.01) A01P 1/00(2006.01) (54)发明名称 特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA及其体外合 成引物和抗病性的应用 (57)摘要 本发明公开了一种特异性抗烟草PVY病毒的 dsRNA及其体外合成引物和抗病性应用， 属于烟 草黄瓜花叶病毒 防治技术领域。 本发明利用RNA 沉默的原理， 利用PVY病毒自身CP基因提供了一 种能够特异性抗PVY病毒的dsRNA， 以及这种 dsRNA的体外合成方法和在烟草PVY病毒防治时 的应用方法； 为烟草烟草马铃薯Y病毒防治提供 新思路， 避免了化学用药的诸多弊端； 该方法简 单有效， 不存在转基因安全风险， 更容易进行大 田推广应用； 后期可以结合细胞工厂化生产 dsRNA， 可为烟草病毒病防治提供一种简单、 有效 和廉价的新方法， 也可为其它植物病毒病防治提 供借鉴。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114736899 A 2022.07.12 CN 114736899 A 1.一种特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所 示。 2.一种体外合成权利要求1所述的特异性抗烟草PVY病毒 的dsRNA的引物对， 其特征在 于， 正向引物PCP ‑F的核苷酸序列为： 5 ’ ‑GCAAATGACACA ATCGATGC ‑3’， 反向引物PCP ‑P的核苷酸序列为： 5 ’ ‑TTGCCTAAGGGTTGGTTTTG‑3’。 3.根据权利要求2所述的引物对， 其特征在于， 在所述正向引物和反向引物的5 ’端还均 添加了T7启动子序列； 添加了T7启动子序列的正向引物PCP ‑T7F的核苷酸序列为： 5 ’ ‑GGATCCTAATACGACTCAC TATAGGGCAAATGACACA ATCGATGC ‑3’； 添加了T7启动子序列的反向引物PCP ‑T7P的核苷酸序列为： 5 ’ ‑GGATCCTAATACGACTCAC TATAGGTTGCCTAAGGGTTGGTTTTG‑3’。 4.权利要求1所述的特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA的体外合成方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： S1、 从感染PVY病毒的烟株叶片中提取烟草PVY病毒的总RNA， 以总RNA为模板， 反转录获 得病毒样本的cDNA； S2、 以步骤S1所 得cDNA为模板进行PCR扩增， 纯化回收目的片段； S3、 将纯化回收的目的片段连接至载体上， 再将载体加入感受态细胞中， 培养扩增， 挑 取阳性克隆的CP蛋 白， 对CP蛋 白进行测序， 获得如SEQ  ID NO.2所示的表达CP蛋 白的PVY病 毒靶基因序列； S4、 比对PVY病毒靶基因序列和已有PVY病毒靶基因序列， 选取保守性较高区域的核苷 酸序列； 转录合成靶序列的正 义链和反义链s sRNA， 混合、 退火得到dsRNA。 5.根据权利 要求4所述的体外合成方法， 其特征在于， 步骤S2中PCR扩增的反应体系为： 5 μL含MgCl2的10×PCR Buffer， 1μL  10 μmol/L  dNTPs， 10 μmol/L的正反 向引物各1μL， cDNA   2 μL， 4U Taq DNA聚合酶， 加灭菌d dH2O至50 μL； 反应程序为： 94℃预变性5min， 94℃变性1min， 58℃退火45s， 72℃延伸1min， 循环30次 后72℃延伸10mi n。 6.根据权利要求4所述的体外合成方法， 其特征在于， 步骤S3具体为： 将目的片段连接 至pMD‑19T载体上， 16℃ 反应4h； 然后将连接产物加至DH5α 感受态细胞中， 冰上孵育30min， 然后42℃热激转化90s， 再加入LB液体培养基， 37℃， 200rpm摇 菌2h； 吸取菌液至含Amp+浓度 为100mg/mL的LB固体培养基中， 37℃培养过夜； 挑取阳性克隆， 进行测序获得表达CP蛋白的 PVY病毒靶基因序列。 7.一种权利要求1所述的特异性 抗烟草PVY病毒的dsRNA在防治烟草PVY病毒中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 取所述特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA， 使 用用于PVY病毒接种的缓冲液配置成混合液， 喷施或涂抹在 烟草叶片上。 9.根据权利 要求8所述的应用， 其特征在于， 使用所述特异性抗烟草PVY病毒的dsRNA配 制的混合液时， 喷施或涂抹的用量以dsRNA计为每片烟叶20 μg。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114736899 A 2特异性抗烟草PVY病毒 的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的 应用 技术领域 [0001]本发明属于烟草黄瓜花叶病毒防治技术领域， 特别是特异性抗烟草PVY病毒的 dsRNA及其体外合成引物和抗病性应用。 背景技术 [0002]烟草马铃薯Y病毒(Potato  virus Y， 以下简称PVY病毒)是我国烟草上的重要病 害， 每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列。 PVY病毒主要危害烟草、 辣椒， 番茄 等茄科植物， 属于系统性侵染病害。 PVY侵染烟草时， 会导致烟草的叶脉坏死、 褐脉、 黄斑， 影 响了烟叶的质量和产量。 我国受PVY威胁烤烟面积年均300万亩(约20万公顷)。 目前， 烟草在 种植、 生产时， 主要采取治虫防病、 药剂防治等措施防治， 防治效果不高。 局部地区PVY暴发 的情况仍然时有发生， PVY的防控仍然是烟叶生产中的一个热点和难点。 [0003]PVY病毒基因组编码 一个大的多聚蛋白， 长为360kD， 进行翻译表达的过程中， 包括 经病毒自身编码的NIa、 HC ‑Pro、 PI三种蛋白酶的第 一蛋白(first  protein， PI)， 木瓜 蛋白 酶相似的辅助蛋白(Helper  component proteinase， HC ‑Pro)， 与32kD大小的豌豆花叶病毒 蛋白相似的第三蛋白(third  protein， P3)， 含有两个疏水氨基酸序列的6kD蛋白6K 1和6K2， 与解旋酶相似的圆柱形内含体蛋白(cylindrical  protein， CI)， 具有丝氨酸蛋白酶特性的 核内含体蛋白a(Nuclear  Inclusion  body‘a’protein， NIa)， 具有核定位信号的核内含体 蛋白b(Nuclear  Inclusion  body‘b’protein， NIb)和外壳蛋白CP。 黄瓜花叶病毒(cucumber   mosaic virus， CMV)的基因组分别在3条正义单链的RNA分子中， 编码5个蛋白， 即复制酶1a、 2a、 2b蛋白和移动蛋白(movement  protein， MP)、 外壳蛋白(coat  protein， CP)。 其中外壳蛋 白CP是PVY唯一的结合蛋白， 参与到病毒传播和增殖进程， 是PVY病毒病 生物防治的一个理 想靶基因。 [0004]近年来， RNA干扰技术(RNA  interference， RNA i)在作物抗病虫害领域逐渐崭露头 角。 它是指在转录后通过RNA调控基因表达， 在真核细胞中引入双链RNA(即dsRNA)分子从而 导致具有序列同源性的基因产生的特异性基因沉默(gene  silencing)现象。 当真核细胞内 出现dsRNA时， 胞质中的核酸内切酶Dicer便将其切割成长度为21 ‑23bp的小片段RNA(即 siRNA)。 在RNA解旋酶的作用下， siRNA双链被解开形成正义链和反义链。 此刻出现的反义链 随后与内切酶、 外切酶及解旋酶等结合形成具有核酸 酶功能的RNA 诱导的沉默复合物(RNA ‑ induced silencing  complex， RISC)。 RISC与mRNA中的同源区特异性结合并在与siRNA反义 链互补结合的两端切割mRNA， mRNA一旦被这样切割便立即被降解。 通过这种方式， dsRNA引 发了细胞对其同源靶基因RNA的降解反应。 目前， 已有研究通过体外合 成P126(TMV  RNA沉默 抑制)和外壳蛋白(CP)基因的dsRNA， 与烟草花叶病毒(TMV)混合接种烟草后， 烟株获得了 TMV抗性， 外源的dsRNA同样诱导了烟株本身的系统性RNAi， 在未接种的其他叶片组织中也 检测到了RNAi效应。 澳大利亚学者通过将CMV病毒2b基因的dsRNA分子与黏土纳米颗粒LDH 紧密结合， 能够让dsRNA长时间停留在植物叶面， 从而将RNAi沉默基因的作用时间可以延 长说　明　书 1/6 页 3 CN 114736899 A 3