(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210344322.2 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市东肖北路1号 (72)发明人 戴爱玲　张鑫杰　王泓锴　薛少华　 陈羽璇　刘小梅　杨小燕　范克伟　 (74)专利代理 机构 福州君诚知识产权代理有限 公司 35211 专利代理师 张耕祥 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测 的引物和探 针组及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了4型和6型猪细小病毒双重荧 光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒， 所述 引物和探针组由PPV 6的上游引物PPV 6‑F、 下游引 物PPV6‑R和探针PPV6 ‑P以及PPV4的上游引物 PPV4‑F、 下游引物PPV4 ‑R和探针PPV4 ‑P组成， 所 述PPV6‑F、 PPV6‑R、 PPV6‑P、 PPV4‑F、 PPV4‑R、 PPV4‑P的核苷酸序列分别如SEQ  ID NO:1~SEQ  ID NO:6所示。 本发明建立的双重荧光定量PCR检 测方法对于猪细小病毒6型的检测灵敏度可达到 7.7copies/μl， 对于猪细小病毒 4型的检测灵敏 度可达到9.3copies/μl， 对于单个样本的检测 时间为1小时， 可同时进行大批量的样本检测， 具 有良好的特异性、 敏感性和稳定性， 可 以实现对 猪细小病毒6型和猪细小病毒4型 快速检测。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114908189 A 2022.08.16 CN 114908189 A 1.4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测的引物和探针组， 其特征在于， 其由PPV6 的上游引物PPV6 ‑F、 下游引物PPV6 ‑R和探针PPV6 ‑P以及PPV4的上游引物PPV4 ‑F、 下游引物 PPV4‑R和探针PPV4 ‑P组成， 所述PPV6 ‑F、 PPV6‑R、 PPV6‑P、 PPV4‑F、 PPV4‑R、 PPV4‑P的核苷酸 序列及修饰依次如下 所示： PPV6‑F： TCCCGTTTCAAGACATTGTGA； PPV6‑R： GCCTTAGCACAT TCAACCAC； PPV6‑P： FAM‑TTCCTTCCTCCCACCAACCCA‑BHQ1； PPV4‑F： AAACATTCCGCTTTTGAGTTCCA； PPV4‑R： CCCACTTGGCAGTTTACCTC； PPV4‑P： VIC‑AATGCCAGGTCACCCGTCACA‑BHQ1。 2. 4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1 所述的引物和探针组， 阳性对照， 标准质粒pMD ‑PPV6和pMD ‑PPV4， 阴性对照， 双蒸水， 探针 法 荧光定量预混试剂TaqMan  multiplex  qPCR master mix。 3.根据权利要求2所述的4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在 于， 所述标准质粒pMD ‑PPV6的拷贝数为7.7 ×109拷贝/μl， 标准质粒pMD ‑PPV4的拷贝数为 9.3×109拷贝/ μl。 4.根据权利要求2所述的4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在 于， 所述阴性对照为Rnase ‑free ddH2O， 所述阳性对照为PPV4和PPV6基因片段的混合重组 质粒。 5. 如权利要求2所述的4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测试剂盒的使用方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 提取样品DNA （2） 配置双重荧 光定量PCR反应 体系， 体系如下： TaqMan multiplex  qPCR master mix 10 μl； PPV6‑F 0.5 μl， 终浓度10 μM； PPV6‑R 0.5 μl， 终浓度10 μM； PPV6‑P 1 μl， 终浓度10 μM； PPV4‑F 0.5 μl， 终浓度10 μM； PPV4‑R 0.5 μl， 终浓度10 μM； PPV4‑P 0.5 μl， 终浓度10 μM； 模板DNA1.5 μl， 加入双蒸水将体系补足至20 μl； （3） 双重荧光定量PCR反应条件为： 95℃预变性5min； 循环反应包括95℃  10s， 58℃   30s， 共设置45个 循环， 并在6 0℃最后一秒设置收集 荧光信号。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908189 A 24型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测的引物和探针组 及试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测 的引物和探针组及试剂盒。 背景技术 [0002]猪细小病毒(porcine  parvovirus， PPV)是一类单股线性DNA病毒， 无囊膜， 基因组 长度约为4.0～6.1kb。 1965年， PPV1首次分离于德国， 被认 为是引起世界范围内猪繁殖障碍 的主要原因之一， 且经常与PCV ‑2混合感染， 共同引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。 PPV4首 次发现于美国北卡罗来纳州， 并且与PCV2有较高的共感染率。 2014年， Ni等从流产胎儿的组 织样品中鉴定出PPV6， 并且该组织样品中不包含其他可造成繁殖障碍的病原， 包括PRV、 PRRSV、 PPV1、 PCV2、 CSFV、 SIV和布鲁氏杆菌。 随后， Schirt zinger等在美国 的PRRSV阳性样品 中检出PPV6。 目前PPV4与PPV6均在流产 胎儿中被发现， 并且具有较高感染率。 [0003]目前虽然针对PPV4及PPV6建立了相关的多重PCR方法， 但尚未发现基于TaqMan探 针的PPV4与PPV6的双重荧光定量PCR检测方法。 而普通PCR方法存在着灵敏度低、 产物需要 进行凝胶电泳实验进 行鉴定等缺点。 因此迫切需要一种能够同时鉴定PPV 4及PPV6的双重荧 光定量PCR检测方法。 发明内容 [0004]鉴于PPV4及PPV6的高感染率， 而目前针对PPV4和PPV6检测技术手段的缺乏， 本发 明提供4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测的引物和 探针组及试剂盒。 建立的双重 荧光定量PCR检测方法对于猪细小病毒6型的检测灵敏度可达到7.7copies/ μl， 对于猪细小 病毒4型的检测灵敏度可达到9.3copies/ μl， 对于单个样本的检测时间为1小时， 可同时进 行大批量的样本检测， 具有良好的特异性、 敏感性和稳定性， 可以实现对猪细小病毒6型和 猪细小病毒4型 快速检测。 [0005]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0006]4型和6型猪细小病毒双重荧光定量PCR检测的引物和探针组， 其 由PPV6的上游引 物PPV6‑F、 下游引物PPV6 ‑R和探针PPV6 ‑P以及PPV4的上游引物PPV4 ‑F、 下游引物PPV4 ‑R和 探针PPV4 ‑P组成， 所述PPV6 ‑F、 PPV6‑R、 PPV6‑P、 PPV4‑F、 PPV4‑R、 PPV4‑P的核苷酸序列及修 饰依次如下 所示： [0007]PPV6‑F： TCCCGTTTCAAGACATTGTGA(SEQ  ID NO:1) [0008]PPV6‑R： GCCTTAGCACAT TCAACCAC(SEQ ID NO:2) [0009]PPV6‑P： FAM‑TTCCTTCCTCCCACCAACCCA‑BHQ1(SEQ ID NO:3) [0010]PPV4‑F： AAACATTCCGCTTTTGAGTTCCA(SEQ ID NO:4) [0011]PPV4‑R： CCCACTTGGCAGTTTACCTC(SEQ ID NO:5) [0012]PPV4‑P： VIC‑AATGCCAGGTCACCCGTCACA‑BHQ1(SEQ ID NO:6)说　明　书 1/6 页 3 CN 114908189 A 3