(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210346819.8 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 苏州药明泽康生物科技有限公司 地址 215127 江苏省苏州市工业园区桑田 街218号生物医药产业园3 0号楼 (72)发明人 杨超超　施丽君　赵冬婷　潘建芳　 李宇　 (74)专利代理 机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 3121 1 专利代理师 刘昌荣 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6841(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6804(2018.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于原位杂交法的EB病 毒检测方法， 所述检测方法采用EBER特有序列设 计的地高辛标记探针特异的与组织或细胞中的 EBER靶序列互补、 杂交， 对细胞或组织样本中的 EB病毒进行定性分析， 包括样本脱蜡处理、 酶处 理、 滴加EBER探针及配套的二抗、 DAB显色、 复染、 脱水透明和封片等步骤。 本发明提供的检测方 法， 选择鼠抗地高辛抗体、 羊抗鼠抗体和酶标抗 羊IgG聚合物作为配套EBER探针使用的二抗系 统， 使得探针与细胞或组织切片中核酸杂交结合 的特异性好， 能够扩大杂交信号， 提高了检测的 准确度和灵敏度。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 115125331 A 2022.09.30 CN 115125331 A 1.一种基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 采用EBER探针特异的与样本 中的EBER靶序列互补、 杂交， 对细胞或组织样本中的EB病毒 进行定性分析， 包括以下步骤： 1)制备EBER检测试剂盒试剂， 所述EBER检测试剂盒试剂包括EBER探针、 胃酶工作液、 鼠 抗地高辛抗体、 羊抗鼠抗体、 酶标抗羊IgG聚合物、 DAB色原浓 缩液和DAB底 物缓冲液； 2)样本准备： 对待测细胞或组织样本进行取材、 固定、 脱水和石蜡包埋处理， 制成蜡块， 所述样本厚度为3 ‑5 μm， 将所述样本黏附在聚赖氨酸载玻片上， 在 空气中干燥后， 60℃烤片 1‑2小时； 3)酶处理： 根据所述样本的大小， 滴加1 ‑3滴胃酶工作液， 37℃下孵育10分钟， 纯化水冲 洗2次， 最后使用空气干燥样本； 4)滴加探针： 根据所述样本的大小， 滴加EBER探针， 加硅化盖玻片， 使用橡胶水泥进行 封边， 37℃下杂交孵 育2‑4小时或过夜； 5)去除橡胶水泥， 将样本浸入PBS缓冲液内10分钟， 再用PBS缓冲液冲洗3次， 每次2分 钟； 6)滴加鼠抗地高辛抗体： 向样本中加入1 ‑3滴鼠抗地高辛抗体， 至完全覆盖样本， 在37 ℃下孵育30分钟， 使用PBST冲洗 3次， 每次5分钟； 7)滴加羊抗鼠抗体： 向样本中加入1 ‑3滴羊抗鼠抗体， 至完全覆盖样本， 在室温下孵育 10分钟， 使用PBST冲洗 3次， 每次5分钟； 8)滴加酶标抗羊IgG聚合物： 向样本中加入1 ‑3滴酶标抗羊IgG聚合物， 至完全覆盖样 本， 在室温下孵 育30分钟， 使用PBST冲洗 3次， 每次5分钟； 9)DAB显色： 制备DAB工作液， 向样本中加入DAB工作液， 至完全覆盖样本进行染色， 染色 结束后使用纯化水冲洗样本； 10)复染： 使用苏木素进行复染， 复染后使用PBS或自来水冲洗返蓝； 11)脱水透明： 将样本依次浸泡浓度梯度为70 ％‑100％的酒精， 再浸泡纯二甲苯进行透 明处理， 进行2次， 每次3分钟， 结束后对样品进行封片。 2.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤1)中， 所述EBER探针、 胃酶工作液、 鼠抗地高辛抗体、 羊抗鼠抗体和酶标抗羊IgG聚合物均为即用 型试剂， 所述EBER探针为特有序列设计的地高辛标记探针。 3.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤1)中， 所述DAB为3,3 ’ ‑二氨基联 苯胺。 4.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤2)中， 所述脱蜡处理是指将3 ‑5 μm的石蜡切片置于二甲苯中浸泡脱蜡2次， 每次10分钟， 随后置于 无水乙醇中浸泡2次， 每次3分钟， 最后经空气干燥5 ‑10分钟。 5.根据权利 要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤3)、 6)、 7)和8)中， 所述孵 育是指在原位杂交仪或湿盒内进行孵 育。 6.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤8)中， 所述酶标抗羊IgG聚合物为多聚体HRP偶联的二 抗。 7.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤9)中， 所述DAB工作液由所述DAB色原浓缩 液和DAB底物缓冲液按比例混合而成， 所述比例为每800 μL的DAB底 物缓冲液中加入一 滴DAB色原浓 缩液。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115125331 A 28.根据权利 要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤10)中， 所述返蓝是指观察样本中的细胞核呈蓝色。 9.根据权利 要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤11)中， 所述浓度梯度为70％、 85％、 95％和10 0％。 10.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤11) 中， 所述封片是指使用中性 树胶对样品进行封片。 11.根据权利要求1所述的基于原位杂交法的EB病毒检测方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述杂交孵 育2‑4小时或过夜是指在原位杂交仪内或湿盒内杂交孵 育2‑4小时或过夜。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115125331 A 3