(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210335339.1 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 四川大学 地址 610044 四川省成 都市一环路南 一段 24号 (72)发明人 唐田　周琛　方楚斌　费宇　方蓉　 肖丽娜　廖娟　汪川　 (74)专利代理 机构 济南凳凳知识产权代理有限 公司 37386 专利代理师 罗如意 (51)Int.Cl. G01N 33/569(2006.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆 菌快速检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及幽门螺杆菌检测技术领域， 公开 了一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌 快速检测试剂盒， 所述试剂盒包括幽门螺杆菌特 异性核酸适配体和经纳米金颗 粒(AuNPs)修饰的 寡核苷酸探针， 所述寡核苷酸探针包括探针 Probe‑120和Probe ‑220， Probe‑120的5’端和 Probe‑220的3’端分别修饰有巯基(SH)。 本发明 通过AuNPs在聚集和解聚过程中颜色的变化， 实 现了对较低浓度幽门螺 杆菌(25CFU/ml)的检测， 且具有较良好的特异性， 本发明与C13呼气检测 法相比具有检测成本低、 检测时间短以及不具有 放射性等优点， 因而有望成为临床中幽门螺杆菌 感染检测的一种新手段。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 114705855 A 2022.07.05 CN 114705855 A 1.一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒， 其特征在于， 所述试 剂盒包括幽门螺杆菌特异性核酸适配体和经AuNPs修饰的寡核苷酸探针， 所述幽门螺杆菌 特异性核酸适配体的核苷酸序列见SEQ  ID NO： 1， 所述寡核苷酸探针包括探针Probe ‑120和 Probe‑220， Probe‑120的5’端和Probe ‑220的3’端均修饰有巯基， Probe ‑120和Probe‑220的核 苷酸序列分别见SEQ  ID NO： 2和SEQ  ID NO： 3。 2.根据权利要求1所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂 盒， 其特征在于， 经AuNPs修饰的寡核苷酸探针的制备方法如下： 首先采用柠檬酸钠还原法 制备AuNPs溶液， 制备方法如下： 将15mg  HAuCl4溶于51.5ml去离子水中， 搅拌加热至 100℃； 随后加入3.5ml  1％柠檬酸钠溶液(w/v)并继续加热直至溶液由浅黄色变为暗红色， 得到 AuNPs溶液； 之后对寡核苷酸探针进行修饰， 修饰方法如 下： 将20 μl寡核苷酸探针与 等体积的三(2 ‑ 羧乙基)膦盐酸盐混合后室温孵育2小时， 随后加入150 μl制备好的AuNPs溶液， 室温孵育4小 时； 将孵育后的溶液以12000rpm  4℃离心30分钟， 用200 μl 缓冲液重悬沉淀即得， 于4℃下保 存备用。 3.根据权利要求2所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂 盒， 其特征在于， 所述缓冲液的组成如下： 100mM  NaCl， 5mM  KCl， 50mM  Tris‑HCl， 1mM  MgCl2， pH 7.5。 4.根据权利要求3所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒的检测方法如下： 将5 ×5mm的粪便样本用500 μl生理盐水稀释 混匀后得到样 本悬液， 随后将 5 μl幽门螺杆菌特异 性核酸适配体与200 μl经胶体金修饰的寡 核苷酸探针溶液混合， 于室温下孵育10min， 再加入10 μl样 本悬液并于室温孵育10min， 最后 通过肉眼观察或使用紫外分光光度计检测反应液， 当反应液体系中不存在幽门螺杆菌时， 反应液颜色由暗红色变为紫色， 当反应液体系中存在幽门螺杆菌时， 反应液颜色则为暗红 色。 5.根据权利要求4所述的一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒的检出限为25 CFU/mL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114705855 A 2一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及幽门螺杆菌检测技术领域， 具体涉及 一种基于比色生物传感器的粪样 幽门螺杆菌快速检测试剂盒。 背景技术 [0002]幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌， 其与许多消化道疾病如慢性胃炎、 消化性溃疡 及胃癌等的发生息息相关， 是世界卫生组织 公布的I类致癌因子。 全球 幽门螺杆菌感染率约 为41％， 而中国人群的幽门螺杆菌感染率高达 59％。 [0003]目前针对幽门螺杆菌的检测方法大致可分为侵入性和非侵入性两种。 非侵入性检 测方法(non ‑invasive  detection， NID)包 括粪便抗原检测法(stool  antigen test， SAT)、 抗体检测法(antibody ‑based test， ABT)以及C13呼气检测法(C13 ‑urea breath test， C13‑UBT)等。 其中， C13呼气检测法因高灵敏度和特异性等优点 成为现阶段临床应用最广的 一种幽门螺杆菌检测法。 然而， C13呼气检测法的检测准确性容易受到一些因素， 诸如饮食 及药物等的影响。 因此， 急需建立一种新型的、 不易受外源因素干扰的非侵入性幽门螺杆菌 快速检测法， 以弥补现有检测技 术的不足。 [0004]近些年来， 生物传感器技术领域迎来了前所未有的变革与发展， 尤其是比色生物 传感器技术领域。 基于比色生物传感器建立的检测法具有成本低、 操作简 便、 灵敏度及特异 度高等优点。 更为重要的是， 比色生物传感器技术可通过颜色变化对检测结果进行直观判 读， 因而有望在临床快速诊断、 新药评价及环境污染物监测等方面 发挥重要作用。 本发明旨 在建立一种基于纳米金颗粒(AuNPs)的比色生物传感器检测法， 通过 肉眼或借助紫光 吸收 光谱仪判定结果， 实现对粪便中幽门螺杆菌的快速检测。 发明内容 [0005]基于以上问题， 本发明提供一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌快速检测 试剂盒， 本试剂盒与比色生物传感器检测技术结合具有较快的检测速度和较低的检测成 本， 检出限与已有方法的检出限相当甚至更优。 [0006]为解决以上技术问题， 本发明提供了一种基于比色生物传感器的粪样幽门螺杆菌 快速检测试剂盒， 所述试剂盒包括幽门螺杆菌特异性核酸适配体和经纳米金颗粒(AuNPs) 修饰的寡核苷 酸探针， 所述幽门螺杆菌特异 性核酸适配体的核苷 酸序列见S EQ ID NO： 1， 所 述寡核苷酸探针包括探针Probe ‑120和Probe‑220， Probe‑120的5’端和Probe ‑220的3’端均修 饰有巯基(SH)， Probe ‑120和Probe‑220的核苷酸序列分别见SEQ  ID NO： 2和SEQ  ID NO： 3。 [0007]进一步的， 经纳米金颗粒(AuNPs)修饰的寡核苷酸探针的制备方法如下： 首先采用 柠檬酸钠还原法制备AuNPs溶液， 制备方法如下： 将15mg  HAuCl4溶于51.5ml去离子水中， 搅 拌加热至100℃； 随后加 入3.5ml 1％柠檬酸钠溶液(w/v)并继续加热直至溶液由浅黄色变 为暗红色， 得到AuNPs溶 液； [0008]之后对寡核苷酸探针进行纳米金颗粒(AuNPs)修饰， 修饰方法如下： 将20 μl寡核苷说　明　书 1/5 页 3 CN 114705855 A 3