(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210353127.6 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 杭州丹威 生物科技有限公司 地址 311121 浙江省杭州市余杭区仓前街 道余杭塘路2959号4幢2层、 6层601、 9 层902、 1幢2层 (72)发明人 陶晔琪　曹玉婷　张苗雷　郭兴中　 陈文　朱小娟　 (74)专利代理 机构 杭州君锐知产专利代理事务 所(普通合伙) 33443 专利代理师 方琦 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) G01N 33/569(2006.01)G01N 33/543(2006.01) G01N 33/577(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种Ⅰ型副流感病毒、 Ⅲ型副流感病毒和腺 病毒的多重富 集检测方法 (57)摘要 本发明涉及分子生物学领域， 具体涉及一种 Ⅰ型副流感病毒、 Ⅲ型副流感病毒和腺病毒的多 重富集检测方法。 该方法包括如下步骤： S1、 免疫 磁珠的制备： 将 Ⅰ型副流感病毒、 Ⅲ型副流感病毒 和腺病毒三种抗体分别偶联至羧基修饰的超顺 纳米磁珠上， 得到三种偶联病毒抗体的免疫磁 珠； S2、 病毒的富集： 将 Ⅰ型副流感病毒阳性或 Ⅲ 型副流感病毒阳性或呼腺病毒阳性的样本保存 液， 与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵育； S3、 用磁性工具分离免疫磁珠 ‑病毒复合物， 将免 疫磁珠‑病毒复合物重悬于TE缓冲液中加热裂 解； S4、 用磁性工具分离磁珠， 得到富集浓缩的病 毒， 用多重荧光PCR试剂对裂解产物中的液体直 接进行检测。 权利要求书2页 说明书12页 序列表3页 附图11页 CN 114891924 A 2022.08.12 CN 114891924 A 1.一种用于I型副流感病毒、 III型副流感病毒和腺病毒的多重荧光PCR检测的引物探 针组合物， 其特征在于 该组合物包括如SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.13所示的核苷酸序列， 具 体是： 2.一种用于I型副流感病毒、 III型副流感病毒和腺病毒的多重荧光PCR检测的试剂盒， 该试剂盒包 含权利要求1所述的引物探针组合物。 3.一种I型副流感病毒、 III型副流感病毒和腺病毒的多重富集检测方法， 该方法用于 非疾病诊断目的， 其特 征在于该 方法包括如下步骤： S1、 免疫磁珠的制备： 将I型副流感病毒、 III型副流感病毒和腺病毒三种抗体分别偶联 至羧基修饰的超顺纳米 磁珠上， 得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠； S2、 病毒的富集： 将I型副流感病毒阳性或III型副流感病毒阳性或呼腺病毒阳性的样 本保存液， 与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵 育， 得到免疫磁珠 ‑病毒复合物； S3、 用磁性工具分离免疫磁珠 ‑病毒复合物， 将免疫磁珠 ‑病毒复合物重悬于TE缓冲液 中加热裂解； S4、 用磁性工具分离磁珠， 得到富集浓缩 的病毒， 用多重荧光PCR试剂对裂解产物中的 液体直接进行检测； 该多重荧 光PCR试剂包 含权利要求1所述的引物探针组合物。 4.根据权利 要求3所述的多重富集检测方法， 其特征在于： 步骤S4所述荧光PCR试剂(20 μL)包含以下组分： 如SEQ  ID No： 1至SEQ  ID No： 2所示的核苷酸序列的引物， 终浓度0.2 μM； 如SEQ ID No： 3至SEQ  ID No： 5所示的核苷酸序列的引物， 终浓度0.3 μM； 如SEQ  ID No： 6所 示的核苷酸序列的引物， 终浓度0.13 μM； 如SEQ  ID No： 7至SEQ  ID No： 9所示的核苷酸序列权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891924 A 2的引物， 终浓度0.3 μM； 如SEQ  ID No： 10所示的核苷酸序列的引物， 终浓度0.2 μM； 如SEQ  ID  No： 11至SEQ ID No： 13所示的核苷酸序列的引物， 终浓度0.1 μM 。 5.根据权利 要求3所述的多重富集检测方法， 其特征在于： 步骤S4所述荧光PCR试剂(20 μL)包含以下组分： DNA聚合酶及逆转录酶混合液2 μL/份， 5 ×Reaction  Buffer(含镁离子及 dNTP)6 μL/份。 6.根据权利要求3所述的多重富集检测方法， 其特征在于： 步骤S1所述I型副流感病 毒、 III型副流感病毒和腺病毒三种抗体均为单 克隆病毒表面 抗体。 7.根据权利要求3所述的多重富集检测方法， 其特征在于： 步骤S2所述病 毒的富集具体 方法为： 取样本 保存液200 μL与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠各5 μL混合， 25 ‑37℃混匀6 ‑15 分钟。 8.根据权利要求3所述的多重富集检测方法， 其特征在于： 步骤S3所述的加热裂解是： 在85‑95℃加热5 ‑15分钟裂解病毒释放核酸。 9.根据权利 要求3所述的多重富集检测方法， 其特征在于： PCR扩增反应条件： 52℃持续 15min； 95℃持续1mi n； (95℃持续5s； 58℃持续3 0s并采集 荧光)45个循环。 10.根据权利要求3所述的多重富集检测方法， 其特征在于： 所述超顺纳米磁珠直径为 200nm‑350nm， 表面带有羧基( ‑COOH)基团； 所述免疫磁珠制备具体为： 利用EDC活化法将单 克隆表面抗体连接到表 面带羧基( ‑COOH)的超顺纳米磁珠表面， 并用BSA对偶联了抗体后的 磁珠进行封闭； 所述免疫磁珠所偶联的病毒抗体为指I型副流感病毒HN抗体、 III型副流感病毒HN抗 体、 腺病毒Hexo n蛋白抗体， 是 单克隆抗体或多克隆抗体。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891924 A 3