(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210335789.0 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 生工生物工程 （上海） 股份有限公司 地址 201600 上海市松江区香闵路698号 (72)发明人 余纪尖　辛波波　伍先桥　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 宋南 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种线粒体全基因组测序的引物集及高通 量测序的方法 (57)摘要 本发明公开了一种线粒体全基因组测序的 引物集及高通量测序的方法， 涉及基因组测序技 术领域。 引物集包括： 至少两个引物子集， 引物集 包括如SEQ ID NO.1‑202所示的101对引物 。 该引 物集及高通量测序方法极大程度上精简了操作 步骤， 满足较少数据量条件下也能获得更高的测 序深度， 降低测序成本。 甚至对于低质量的FFPE 样品也能满足高通 量测序需求。 权利要求书1页 说明书6页 序列表32页 附图4页 CN 114480578 A 2022.05.13 CN 114480578 A 1.一种线粒体全基因组测序的引物集， 其特征在于， 其包括： 至少两个引物子集， 所述 引物集包括如SEQ  ID NO.1‑202所示的101对引物。 2.根据权利要求1所述的引物集， 其特征在于， 所述引物集包括2个、 3个或4个引物子 集。 3.根据权利要求2所述的引 物集， 其特征在于， 所述引物集包括如SEQ  ID NO.1‑102所 示的第一引物子集和如SEQ  ID NO.103‑202所示的第二引物子集。 4.根据权利要求2所述的引物集， 其特征在于， 在同一引物子集内的任意两个引物对的 扩增产物互不重 叠； 优选地， 用某一引物子集产生的任一个扩增产物与其他子集的一个或多个扩增产物存 在重叠区。 5.一种PCR扩增体系， 其特 征在于， 其包括权利要求1 ‑4任一项所述的引物集。 6.根据权利要求5所述的PCR扩增体系， 其特征在于， 所述PCR扩增体系还包括缓冲体 系， 所述引物集 位于所述缓冲体系中； 优选地， 每一个引物子集对应一个所述缓冲体系。 7.一种试剂盒， 其特 征在于， 其包括权利要求1 ‑4任一项所述的引物集。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中的引物集包括如SEQ  ID  NO.1‑102所示的第一引物子集和如SEQ  ID NO.103‑202所示的第二引物子集， 第一引物子集中SEQ  ID NO.1‑100所示的引物的浓度为C1， SEQ  ID NO.101‑102所示的 引物的浓度为C2， 第二引物子集中SEQ  ID NO.103‑104所示的引物的浓度为C3， SEQ  ID  NO.105‑200所示的引物的浓度为C4， SEQ  ID NO.201‑202所示的引物的浓度为C 5。 9.如权利要求1 ‑4任一项所述的引物集、 权利要求5 ‑6任一项所述的PCR扩增体系或权 利要求7‑8任一项所述的试剂盒在人线粒体全基因 组高通量测序中的应用。 10.一种人线粒体全基因 组高通量测序的方法， 其特 征在于， 所述方法包括 步骤： 利用权利要求1 ‑4任一项所述的引物集， 对待测的基因组DNA样品进行PCR扩增， 从而获 得不同引物子集的扩增产物的混合物， 进行测序分析， 且所述的方法是非疾病的诊断和非 疾病的治疗性方法； 优选地， 将不同引物子集的扩增产物进行等摩尔量混合， 经过第二轮扩增加上接头、 index序列后上机测序分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480578 A 2一种线粒体全基因组测序的引物集 及高通量测序的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及基因组测序技术领域， 具体而言， 涉及一种线粒体全基因组测序的引 物集及高通 量测序的方法。 背景技术 [0002]线粒体是细胞中提供能量代谢的重要细胞器， 在 生物体能量转换和新陈代谢中处 于核心地位。 人类体细胞中线粒体DNA(脱氧核糖核酸)的突变会引起氧化磷酸化和能量供 应异常， 进而引起150余种人类疾病的发生， 例如心血管疾病、 耳聋、 神经退行性疾病及衰 老 等。 [0003]线粒体DNA的突变包括大片段的插入/缺失， 小片段的插入/缺失， 点突变等。 突变 可以发生在编码区， 也可以发生在非编码区。 目前需要快速捕获线粒体并进行高通量测序 的技术不多， 或者 技术较为复杂。 [0004]现有专利CN106399553B提供的高通量测序方法通过73对引物分成4个子集分别扩 增， 该方法需要特定的核酸外切酶消化单链DNA， 引物二聚体， 再通过连接酶连接构建测序 文库， 操作复杂， 且需要平均300Mbp的数据量才能达到较高的测序深度和序列覆盖度， 测序 成本大。 [0005]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种线粒体全基因组测序的引物集及高通量测序的方法 以精简操作步骤， 满足较少数据量条件 下也能获得更高的测序深度， 降低测序成本。 甚至对 于低质量的F FPE样品也能满足高通 量测序需求。 [0007]本发明是这样实现的： [0008]本发明提供了一种线粒体全基因组测 序的引物集， 其包括： 至少两个引物子集， 引 物集包括如SEQ  ID NO.1‑202所示的101对引物。 [0009]发明人设计合成了多重扩增的引物， 该多重扩增引物设计原则如下： [0010](1)引物退火温度Tm值范围58 ‑64摄氏度； [0011](2)扩增产物长度分布在140 ‑260bp之内； [0012](3)引物之间不会形成二聚体； [0013](4)覆盖线粒体序列全长 。 [0014]通过设计上述101对引物， 可以实现人线粒体全长的覆盖， 覆盖率达99.8％ 以上。 意味着在极少的数据量下， 即可获得 更高的测序深度， 降低测序成本 。 [0015]上述扩增引物可以降低模板使用量， 可以稳定检测低至10ng的样品， 甚至低质量 的FFPE样 品也可以。 另外， 本发明提供的引物集， 产生的扩增产物长度较小(扩增产物仅为 300bp左右)， 可以兼容主流的I llumina测序平台的PE15 0以上测序读长， 方便测序。 [0016]上述设置至少两个引物子集可以保证扩增 产物的片段不会参差不齐， 片 段长度差说　明　书 1/6 页 3 CN 114480578 A 3