(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210328733.2 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 海南医学院 地址 571199 海南省海口市龙华区学院路3 号 (72)发明人 潘坤　侯杰　刘嘉祺　罗喻超　 (74)专利代理 机构 海南汉普知识产权代理有限 公司 46003 专利代理师 吴彩云 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种中药益智EST-S SR标记引物及其应用 (57)摘要 本发明首次开发了中药益智ES T‑SSR标记引 物， 包括20对引物序列， 所述引物可用于对不同 地域来源的中药益智的遗传 多样性和聚类分析， 有助于快速准确的区分不同地域的中药益智种 质， 为益智的定向育种、 品种标准化等建立良好 的基础。 权利要求书1页 说明书6页 序列表13页 附图3页 CN 114774571 A 2022.07.22 CN 114774571 A 1.一种中药益智EST ‑SSR标记引物， 其特征在于， 包括序列表中SEQ  ID NO.1、 SEQ  ID  NO.2、 SEQ  ID NO.19、 SEQ  ID NO.20、 SEQ  ID NO.43、 SEQ  ID NO.44、 SEQ  ID NO.45、 SEQ  ID  NO.46、 SEQ  ID NO.47、 SEQ  ID NO.48、 SEQ  ID NO.49、 SEQ  ID NO.50、 SEQ  ID NO.51、 SEQ  ID  NO.52、 SEQ  ID NO.53、 SEQ  ID NO.54、 SEQ  ID NO.55、 SEQ  ID NO.56、 SEQ  ID NO.59、 SEQ  ID  NO.60、 SEQ  ID NO.61、 SEQ  ID NO.62、 SEQ  ID NO.63、 SEQ  ID NO.64、 SEQ  ID NO.65、 SEQ  ID  NO.66、 SEQ  ID NO.67、 SEQ  ID NO.68、 SEQ  ID NO.69、 SEQ  ID NO.70、 SEQ  ID NO.71、 SEQ  ID  NO.72、 SEQ  ID NO.73、 SEQ  ID NO.74、 SEQ  ID NO.75、 SEQ  ID NO.76、 SEQ  ID NO.77、 SEQ  ID  NO.78、 SEQ  ID NO.79和SEQ  ID NO.80所示的引物序列。 2.权利要求1所述的中药益智EST ‑SSR标记引物在中药益智遗传多样性分析中的应用。 3.根据权利 要求2所述的应用， 其特征在于， 用权利要求1所述的EST ‑SSR标记引物对不 同地域的益智种质资源进行SSR引物筛选和扩增； 计算每对引物在不同地域益智种质资源 的多态性信息 。 4.权利要求1所述的中药益智EST ‑SSR标记引物的应用， 其特征在于， 用权利 要求1中的 SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2引物序列对不同地域来源的益智种质资源进行多态性差异分 析； 所述引物 注释的化 合物为白杨素。 5.权利要求1所述的中药益智EST ‑SSR标记引物的应用， 其特征在于， 用权利 要求1中的 SEQ ID NO.47和SEQ  ID NO.48引物序列对不同地域来源的益智种质资源进行多态性差异 分析； 所述引物所注释的化 合物为杨芽 黄素。 6.权利要求1所述的中药益智EST ‑SSR标记引物的应用， 其特征在于， 用权利 要求1中的 SEQ ID NO.77和SEQ  ID NO.78引物序列对不同地域来源的益智种质资源进行多态性差异 分析； 所述引物 注释的化 合物为圆柚酮。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774571 A 2一种中药 益智EST‑SSR标记引物及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子标记技术领域， 特别涉及一种中药益智EST ‑SSR标记引物及其应 用。 背景技术 [0002]益智Alpinia  oxyphylla Miq.是我国著名四大南药之一， 也是一种由中国卫生部 公布的重要的药食同源植物。 经过长期的人工培育和选择， 形成了丰富的变异， 但目前对于 益智的研究主要集中在化学成分、 药理临床、 栽培学领域， 尚缺少分子机制方面的探索， 能 从NCBI里检索到的益智分子遗传方面的信息仅限23条从益智叶片基因组DNA中开 发出来的 SSR， 其功能基因数据库缺乏， 益智的分子生物学及代谢途径研究几乎是空白的。 利用益智 转录组序列开发EST ‑SSR引物的研究也未 见报道。 [0003]益智药材的质量标准简单， 2010年版 《中国药典》 (一部)[1]中仅规定益智种子含挥 发油不得少于1％(ml/g)， 而对于其中指标性成分 的含量限度暂无规定。 不同地域/产地益 智药效成分的相对含量具有显著差异。 李婷[2]经GC‑MS方法分析广东产益智果 实发现， 香橙 烯Valencene相对含量最高， 为18.31％， 而圆柚酮Nootkatone含量是3.99％。 但黄勤挽[3]等 从广西益智果实挥发油中鉴定出相 对含量最高的化合物则 是圆柚酮(12.11％)。 对于海南 的益智果 实成分含量测定结果也是差异显著， 相对较早的是陈画虹[4]等人针对益智果 实几 个部位的挥发油进行GC ‑MS分析比对， 发现益智种子、 果皮、 全果挥发油含量及油中主要成 分均有显著差异。 其中全果中相对含量最高的是4 ‑异丙基甲苯p ‑cymene(26.71％)， 而圆柚 酮含量是4.57％。 同样罗秀珍等[5]经GC‑MS分析海南产益智果实， 发现挥发油中4 ‑异丙基甲 苯的含量也是最高， 相对含量达44.87％， 而圆柚酮的含量仅为1.27％。 但近年来， 陈新[6]等 人对同一 成熟时期的海南野生益智果 实测定后发现， 其倍半萜类的相对含量却是最高， (E, E)‑α‑金合欢烯(E,E) ‑α‑Farnesene和香橙烯Valencene分别是7.62％和7.51％， 圆柚酮的 相对含量极少为0.326％。 翟红莉[7]的GC‑MS测定结果则发现海南琼中、 屯昌、 白沙和五指山 四地益智果实中圆柚酮的相对含量最高均达30％以上， 但海南不同产地间存在一定差异， 均含有特有成分。 总结以上研究发现不同产地益智果 实的药效成分多样性和含量具有显著 差异。 因此， 构建益智的转录组数据库， 在此基础上开 发出EST‑SSR标记， 利用这些标记对不 同地域益智种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析， 评价其遗传因素在药效成分差异 化 形成上的贡献率， 为其品质形成理论的阐述提供全面的数据， 对益智种质资源保护和种质 创新具有重要意 义。 [0004]参考文献： [0005][1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[S].北京:中国医药科 技出版社,2010:274. [0006][2]李婷,李远志,卢昌阜,等.益智果和叶的挥发油提取及GC ‑MS分析[J].食品科 技,2010,3 5(9):301‑306. [0007][3]黄勤挽,胡昌江,李兴迎,等.益智仁盐炙前后挥发油成分对比研究[J].中国药说　明　书 1/6 页 3 CN 114774571 A 3