(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210349026.1 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 海南医学院 地址 571199 海南省海口市龙华区学院路3 号 (72)发明人 邬强　王媛媛　陈倩　赵宣　 姜成龙　乔斌　 (74)专利代理 机构 成都瑞创华盛知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 51270 专利代理师 邓瑞　辜强 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/682(2018.01)C12N 15/11(2006.01) G01N 21/78(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台及 制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种登革病毒NS1基因片段裸眼 检测平台及制备方法， 所述裸眼检测平台包括杂 交液与Au NRs溶液； 所述杂交液是通过采用DNA 探 针H1和H2对DENV ‑NS1序列进行杂交链式反应得 到杂交反应液； 向杂交反应液加入捕获探针、 信 号放大探针以及底物显色液； 对杂交反应液进行 反应终止操作得到的； 所述AuNRs溶液是通过向 种子生长 液中加入种子溶液搅拌均匀、 孵育并纯 化得到的； 所述裸眼检测平台在使用时采用 AuNRs溶液对杂交液进行AuNRs蚀刻并观察结果。 本发明解决了检测过程中存在依赖大型仪器、 高 成本、 需专业人员检测等问题， 其检测成本低， 无 需复杂昂贵的大型仪器及专业人员即可实现裸 眼对DENV ‑NS1核酸检测， 可用于DENV感 染筛查。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 114763572 A 2022.07.19 CN 114763572 A 1.一种登革病 毒NS1基因片段裸眼检测平台， 其特征在于： 所述裸眼检测平台包括杂交 液与AuNRs溶 液； 所述杂交液是通过采用DNA探针H1和H2对DENV ‑NS1序列进行杂交链式反应得到杂交反 应液； 向杂交反应液加入捕获探针、 信号放大探针以及底物显 色液； 对杂交反应液进 行反应 终止操作得到的； 所述AuNRs溶 液是通过向种子生长液中加入种子溶 液搅拌均匀、 孵 育并纯化得到的； 所述裸眼检测平台在使用时采用AuNRs溶 液对杂交液进行AuNRs 蚀刻并观察结果。 2.根据权利要求1所述的一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台， 其特征在于： 所述 裸眼检测平台在使用时取杂交液加 入酶标板中， 100 μL/每孔， 再加 入AuNRs溶液， 100 μL/每 孔， 37℃孵 育10min， 裸眼观察和拍照记录实验结果。 3.一种登革病 毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其特征在于： 包括杂交液的制 备方法与AuNRs溶 液的制备 方法； 所述杂交液的制备 方法包括以下步骤： S01： 采用DNA探针H1和H2对DENV ‑NS1序列进行杂交链式反应得到杂交反应液； S02： 向杂交反应液加入捕获探针、 信号 放大探针以及底 物显色液； S03： 对杂交反应液进行反应终止操作得到杂交液； 所述AuNRs溶 液的制备 方法包括以下步骤： (1)制备种子液与种子生长液； (2)所述种子生长液中加入种子溶 液搅拌均匀并孵 育得到AuNRs溶 液； (3)对AuNRs溶 液进行纯化。 4.根据权利要求3所述的一种登革病 毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其特征 在于： 所述捕获探针为磁性纳米颗粒 ‑链霉亲和素捕获探针(MBs ‑SA)。 5.根据权利要求3或4所述的一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其 特征在于： 所述信号 放大探针为 辣根过氧化物酶 ‑链霉亲和素信号 放大探针(HRP ‑SA)； 6.根据权利要求3所述的一种登革病 毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其特征 在于： 所述底物显色液为ELISA底物显示液， 所述ELISA底物显示液为3,3',5,5' ‑四甲基联 苯胺(TMB)底 物溶液； 所述底 物显色液中TMB浓度为25 0 μg/mL。 7.根据权利要求3或6所述的一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其 特征在于： 所述 步骤S03的反应终止操作是向杂交反应液加入终止液； 所述终止液为EL ISA终止液， 所述EL ISA终止液为2M硫酸溶 液。 8.根据权利要求3或4所述的一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其 特征在于： 所述种子液是通过向十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中依次加入氯金酸 (HAuCl4)溶液以及硼氢化钠溶 液制得的。 9.根据权利要求3或4所述的一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其 特征在于： 所述种子生长液是通过向十六烷基三甲基 溴化铵(CTAB)溶液中依次加入5 ‑溴水 杨酸溶液、 硝酸银(AgNO3)溶液、 氯金酸(HAuCl4)溶液以及抗坏血酸(A A)溶液制得的。 10.根据权利要求3或4所述的一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台的制备方法， 其 特征在于： 所述 步骤(2)中孵 育得到的AuNRs溶 液为酒红色溶 液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114763572 A 2一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台及制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及登革病毒NS1基因片段(DENV ‑NS1)的分子生物学检测领域， 特别是一 种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台及制备 方法。 背景技术 [0002]登革热(Dengue  fever,DF)是一种经伊蚊传播的急性病毒性传染病， 根据 《中华人 民共和国传染病防治法》 规定， 被列入乙类传染病， 其所致感染病原为登革病毒(Dengue   virus,DENV)。 据WHO预计， 每年有超过5000万人感染登革热， 近25亿人面临感染风险， 严重 影响人类健康和经济发展。 近年来， 世界多国出现登革热疫情， 发病率呈大幅度上升趋势， 主要分布在东南亚、 南美洲、 非洲及东、 西太平洋等地区。 最近几年， 我国多个省份如广东、 云南、 广西、 福建、 台湾和海南陆续 发生登革热疫情 。 由于登革热发病早期无典型症状， 疾病 特征信息与其他 发热疾病区别不明显， 如 诊治不当， 严重者可导致死亡。 目前尚无有效的疫 苗可对登革热进 行预防， 因此对其早 发现、 早诊断、 早治疗， 提高治愈率， 减轻患者痛苦及经 济负担起到至关重要的作用。 因此， 开发一种简单、 高灵敏、 高特异性的分析方法来诊断 DENV具有非常重要的意义。 DENV是继黄热病毒后， 于1903年被证实的第二个人类蚊媒病毒。 分别在上世纪40年代中期和80年代中后期， 先后 分离出了4种血清型DENV及完成全基因组 序列的测定。 DENV属于黄病毒科黄病毒属， 近似二十面体对称的多层足球状结构。 由外至 内， 依次为包膜蛋白(E蛋 白)， 膜蛋白(M蛋 白)、 衣壳蛋 白(C蛋白 )和RNA基因组。 DENV  RNA基 因组长度约为10.6kb， 包括四个区， 5 ′端非编码区、 结构蛋白编码区、 非结构蛋白编码区和 3′端非编码区。 非结构蛋白(包括7个， 分别是NS1、 NS2a、 NS2b、 NS3、 NS4a、 NS4b和NS5)在DENV 传染人时起到重要作用， NS1 蛋白由DENV感染的细胞分泌产生， 可作为D ENV感染的标志 性抗 原。 目前， DENV临床实验室检测主要包括分离培养法、 血清免疫学方法和分子生物学方法。 分离培养法检测对象为DENV病原， 血清学免疫学方法检测对象为DENV抗原或抗体， 分子生 物学方法检测对象为D ENV核酸。 分离培养法由于培养条件苛刻， 实际应用较少； 血清学免疫 学方法需要制备相应抗原抗体， 周期 长。 常用的分子生物学方法需要昂贵的检测仪器、 专 业 的技术人员和严格实验室， 不便 于大范围推广。 发明内容 [0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种登革病毒NS1基因片段裸眼检 测平台及制备方法， 检测成本低， 无需复杂昂贵的大型仪器及专业人员即可实现裸眼对 DENV‑NS1核酸检测， 可用于DENV感染筛查。 [0004]本发明的目的是通过以下技 术方案来实现的： [0005]一种登革病毒NS1基因片段裸眼检测平台， 所述裸眼检测平台包括杂交液与AuNRs 溶液； [0006]所述杂交液是通过采用D NA探针H1和H2对DENV ‑NS1序列进行杂交链式反应得到杂 交反应液； 向杂交反应液加入捕获探针、 信号放大探针以及底物显 色液； 对杂交反应液进 行说　明　书 1/6 页 3 CN 114763572 A 3