(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210338535.4 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 上海睿璟生物科技有限公司 地址 201112 上海市闵行区召楼路3 632号2 幢5层 (72)发明人 石涵　龚伟　高伙妮　 (74)专利代理 机构 北京汇众通达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11622 专利代理师 尹全杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种人甲状 腺癌CCDC6-RET融合型基因表达 检测方法 (57)摘要 本发明公开了基因检测技术领域的一种人 甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征在于： 所述检测方法采用基因检测试剂 盒， 基因检测试剂盒包括核酸扩增试剂和对照 品， 所述核酸扩增试剂为CCDC6 ‑RET融合基因反 应液， 反应液中含有用于检测CCDC6 ‑RET的特异 性引物和探针， 每个反应液中包含一对上游引物 和下游引物， 以及TaqMan荧光探针； 5 ’‑ CGCAAAGCCAGCGTGACCAT ‑3’； 所述下游引物为5 ’ ‑ TCACGGCCACCGTGGTGTAC ‑3’； 所述TaqMan荧光探 针为5’‑(FAM)AGGATCCAAAGTGGGAATTCCC (TAMRA)‑3’， 本发明具有高特异性、 准确性和高 灵敏度等优点。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 114934114 A 2022.08.23 CN 114934114 A 1.一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征在于： 所述检测方法采 用基因检测试剂盒， 基因检测试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品， 所述核酸扩增试剂为 CCDC6‑RET融合基因反应液， 反应液中含有用于检测CCDC6 ‑RET的特异性引物和探针， 每个 反应液中包 含一对上游引物和下游引物， 以及TaqMan 荧光探针。 2.根据权利 要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征 在于： 所述上游引物为5 ’ ‑CGCAAAGCCAGCGTGAC CAT‑3’； 所述下游引物为5 ’ ‑ TCACGGCCACCGTGGTGTAC‑3’； 所述TaqMan 荧光探针为5 ’ ‑ (FAM)AGGATCCAAAGTGGGAATTCCC(TAMRA) ‑3’。 3.根据权利 要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征 在于： 述反应液中包含的引物含量浓度为： 100 μmol/L； 其中引物各0.06 μl， 浓度为100 μmol/ L的探针各0.04 μl。 4.根据权利 要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征 在于： 所述核酸扩增 试剂还包括PCR  Mix， Mix中包括dNTP、 KCl、 Tris ‑HCl、 MgCl2和Taq酶， MIX为2×工作液， 配制时加入体积为总体系量的一半。 5.根据权利 要求1所述的一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征 在于： 所述对照品包括阳性对照和阴性对照， 其中阴性对照为工艺用水， 阳性对照为突变质 粒和野生型细胞株cDNA混合物。 6.根据权利 要求5所述的一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征 在于： 所述的突变质粒包含的CCDC6 ‑RET融合片段序列， 该融合型RNA断裂点附近序列如下 (大写部分为C CDC6基因， 小 写部分为RET基因)： GGTGCTGAAGATAGAGCTGGAGACCTACAAACTGAAGTGCAAGGCACTGCAGGAGGAGAACCGCGACCTGCG CAAAGCCAGCGTGACCATCgaggatccaaagtgggaattccctcggaagaacttggttcttggaaaaactctagga gaaggcgaatttggaaaagtggtcaaggcaacggccttccatctgaaaggcagagcagggtacaccacggtggccg tgaagatgctga。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934114 A 2一种人甲状腺癌C CDC6‑RET融合型基因表达检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 基因检测技术领域的一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测 方法。 背景技术 [0002]RET(ret proto‑oncogene)即RET原癌基因， 位于人染色体10q11.2， 由21个外显子 组成， 编码1100个氨基酸的蛋白。 RET蛋白活化后会激活下游 的信号通路(包含RAS、 MAPK、 ERK、 PI3K、 AKT等)该信号通路会导致细胞的增殖， 迁移与 分化。 染色体重排经常会导致RET 基因中间断裂， 此时RET基因3 ’端激酶结构域会与不同的基因发生融合， 形成驱动肿瘤增殖 的融合基因。 这些基因包括： CCDC6、 NCOA4、 PRKAR1A、 TRIM24、 GOLGA5、 TRIM33、 KTN1、 ERC1、 MBD1、 和TRIM27等 等。 [0003]根据组织发生和形态结构甲状腺癌可分为乳头状甲状腺癌(papillary   thyroidcarcinoma,PTC)、 滤泡型癌、 髓样癌、 未分化癌、 转移癌。 其中,乳头状甲状腺癌是最 常见的甲状腺癌的类型,约占甲状腺癌的50％。 其中5％ ‑40％的甲状腺乳头状癌发现有RET 基因融合。 RET基因融合 也发生在非小细胞肺癌， 发生频率约为1％～ 2％。 [0004]目前， 针对RET融合基因的靶向药物有凡德他尼和卡博替尼等， 这两种药物都获批 用于治疗进展期甲状腺髓样癌。 因此可进一步考虑将CCDC6 ‑RET融合基因的检测用于临床 应用。 由于CCDC6 ‑RET融合基因在以上疾病中的重要作用， 目前对RET基因融合状态的检测 已经成为辅助肿瘤 诊断和治疗的重要手段之一。 临床上， 诊断的金标准为Sanger测序法， 此 办法的优点是： 试验方法简单， 结果直观， 成本低廉。 但是该技术灵敏度不高， 耗时长。 随着 PCR技术的发展， 采用荧光定量PCR技术仅需2小时即可得到检测结果， 分辨率可到达10～ 100拷贝。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供用于辅助肿瘤诊断和治疗的一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融 合型基因表达检测方法。 [0006]本发明所采取的技 术方案如下： [0007]一种人甲状腺癌CCDC6 ‑RET融合型基因表达检测方法， 其特征在于： 所述检测方法 采用基因检测试剂盒， 基因检测试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品， 所述核酸扩增试剂为 CCDC6‑RET融合基因反应液， 反应液中含有用于检测CCDC6 ‑RET的特异性引物和探针， 每个 反应液中包 含一对上游引物和下游引物， 以及TaqMan 荧光探针； [0008]对上述技术方案作进一 步的说明： [0009]所述上游引物为5 ’ ‑CGCAAAGCCAGCGTGAC CAT‑3’； 所述下游引物为 [0010]5’ ‑TCACGGCCACCGTGGTGTAC‑3’； 所述TaqMan 荧光探针为 [0011]5’ ‑(FAM)AGGATCCAAAGTGGGAATTCCC(TAMRA) ‑3’； [0012]对上述技术方案作进一 步的说明：说　明　书 1/3 页 3 CN 114934114 A 3