(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210339139.3 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 中国农业科 学院兰州兽医研究所 地址 730000 甘肃省兰州市城关区盐场堡 徐家坪1号 (72)发明人 孙普　卢曾军　王方洲　张婧　 马雪青　李平花　赵志荀　袁红　 包慧芳　李冬　付元芳　曹轶梅　 李坤　王健　白兴文　刘在新　 (74)专利代理 机构 兰州智和专利代理事务所 (普通合伙) 62201 专利代理师 张英荷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒 的荧光RPA检测引物、 方法及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于美洲型猪繁殖与 呼 吸综合征病毒的荧光RPA检测引物、 方法及试剂 盒。 本发明涉及了用于美洲型猪繁殖与呼吸综合 征病毒的荧光RPA检测引物和探针组合， 包含引 物和探针组合反应体系的检测试剂盒及方法； 该 方法快速省时， 最低检测PRRSV载量为50copies/ μL， 且与常见感染猪的病毒无交叉反应， 特异性 好； 该方法与实时荧光RT ‑PCR检测结果符合率为 100%。 结果表明： 本研究建立的PRRSV实时荧光 RPA检测方法具有特异性强、 敏 感性高， 满足美洲 型PRRSV的快速诊断和流行病学调查。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 114736989 A 2022.07.12 CN 114736989 A 1.一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测的引物和探针组合， 其特 征在于： 正向引物的核苷酸序列为： 5' ‑CACCTTGCTTCCGGAGTTGCACTGCTTTACG ‑3'； 反向引物 的核苷酸序列为： 5'ACATCGTGTGCAGTAGACYTGGCCCTCCGC ‑3'； 探针的核苷酸序列为： 5' ‑TTT AACCATGTCTGGGATACTTGATCGGTGCACG[FAM ‑dT]G[THF][BHQ ‑dT]ACCCCCAATGCCAGG/C3 ‑ spacer‑3'。 2.一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧 光RPA检测方法， 包括以下步骤： （1） 提取待测样品的RNA； （2） 以提取的RNA为模板， 用上述正向引物、 反向引物和探针进行扩增反应并实时检测 荧光信号； （3） 结果判定： 若出现荧光扩增曲线， 且最终荧光信号强度高于25000即可判定为阳性， 检测病毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。 3.根据权利要求2所述的一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测方法， 其 特征在于： 步骤 （2） 中， 所述扩增反应体系为50  μL， 首先配制反应 混合液48  μL， 其中包含20   μL再水化缓冲液、 正向引物和反向引物 各2.1 μL、 探针0.6  μL、 ddH2O 21.2 μL、 模板RNA  2 μ L； 然后将上述反应混合液与重组酶聚合酶冻干酶粉混匀； 最后加入2  μL醋酸镁溶液混匀； 所述正向引物、 反向引物和探针的浓度均为10  μmol /L。 4.根据权利要求3所述的一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测方法， 其 特征在于： 步骤 （2） 中， 扩增反应温度为 42℃， 反应时间为20mi n。 5.一种基于权利要求1所述的用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RPA检测引 物和探针组合的检测试剂盒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114736989 A 2一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒 的荧光RPA检测引 物、 方法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于病毒检测检测技术领域， 涉及 一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病 毒的荧光RPA检测引物、 方法及试剂盒。 背景技术 [0002]猪繁殖与呼吸综合征 （porcine  reproductive  and respiratory  syndrome, PRRS） 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(por cine reproductive  and respiratory  syndrome  virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和不同生长阶段猪的呼吸道疾病 为主要特征的 病毒性传染病， 该疾病可造成持续性感染和免疫抑制， 病原 易发生变异和重组， 混合感染现 象严重， 对养猪业造成了极其严重的危害。 研发和更新快速的诊断方法是防控和净化该病 的重要技 术支撑。 [0003]PRRSV属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员， 分为两个基因型， 即欧洲 型 （基因1型） 和美洲型 （基因2型） ， 我国主要流行美洲型毒株。 中国于1996年首次分离到 PRRSV， 2006年爆发了由高致病性PRRSV （HP ‑PRRSV） 引起的高致病性PRRS(HP ‑PRRS)， 该毒株 致病性极强， 对养猪业造成了毁灭性的打击。 2012  年， 我国报道了与NADC30高度同源的新 变异株， 称为NADC30 ‑like PRRSV， 且于2016  年已超过HP ‑PRRSV 成为我国当前主要流行毒 株。 最新流行病学研究显示， 目前我国PRRS以疫苗样毒株、 HP ‑PRRSV、 NADC30 ‑like、 NADC34 ‑ like、 QYYZ毒株以及衍生的多种重组毒株混合感染， 变异和重组现象极其严重和复杂。 另 外， 国内大多数猪群存在PRRSV阳性， Guo等发现约 80%以上的猪场存在PRRSV  血清阳性 （The   prevalent  status and genetic  diversity  of porcine  reproductive  and  respiratory  syndrome  virus in China: a molecular  epidemiological   perspective） 。 因此， PRRSV的流行病学调查和防控面临着极大挑战， 需求快速而敏感 的病 原学检测技 术。 [0004]由于PRRSV基因组的高变异率及重组， 导致其在国内的流行情况愈加复杂， 多毒株 混合感染， 多基因亚型毒株重组变异在众多猪场中屡见不鲜， 其中NADC30  Like毒株和HP ‑ PRRSV毒株仍然作为目前国内主要流行的毒株[11]， 临床上带毒猪经常出现漏检， 导致隐性 带毒猪的调运加大了疫病的传播和病毒的变异。 鉴于此， 本实验根据目前国内主要流行 的 美洲型PRRSV毒株， 选取HP ‑PRRSV的GSWW15毒株， NADC30 ‑Like PRRSV的GSWW18毒株， 经典 PRRSV的VR ‑2332毒株， 力求做到对当前流行毒株的代表毒株进行涵盖， 从而减少漏检的可 能。 [0005]近年来， PRRSV的实验室检测技术主要有血清学和分子生物学两种， 包括聚合酶链 式反应(Polymerase  Chain Reaction， PCR)、 实时荧光聚合酶链式反应(Quantitative   Real‑Time Polymerase  Chain Reaction， qPCR)、 环介导等温扩增技术(Loop ‑Mediated   Isothermal Amplification， LA MP)、 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 等， 但这些方法均需耗时1h 以上， 且操作繁琐。 重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase  Polymerase  Amplification，说　明　书 1/8 页 3 CN 114736989 A 3