(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210339686.1 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 领航基因科技 （杭州） 有限公司 地址 310000 浙江省杭州市萧 山区南阳街 道横蓬园区红山工业区 (72)发明人 夏江　朱海涛　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 专利代理师 温可睿 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测四种 病原菌的RT-d dPCR试剂 (57)摘要 本发明涉及核酸检测技术领域， 尤其涉及检 测四种病原菌的RT ‑ddPCR试剂。 本发明提供了检 测四种病原菌的RT ‑ddPCR引物探针组和检测试 剂和检测方法。 该引物探针组制成的试剂盒适合 用于对同时含有DNA和RNA的样品的检测， 样品裂 解后的上清液直接作为检测的模板即可获得良 好的检测效果， 检测的灵敏性优于仅对DNA进行 检测， 且不对特异性产生 不良影响。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 CN 114592080 A 2022.06.07 CN 114592080 A 1.检测铜绿假单 胞菌的引物探针组， 其包括： 如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、 如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、 和如SEQ ID NO:3所示序列的探针。 2.检测大肠杆菌的引物探针组， 其包括： 如SEQ ID NO:4所示序列的上游引物、 如SEQ ID NO:5所示序列的下游引物、 和如SEQ ID NO:6所示序列的探针。 3.检测肺炎克 雷伯菌的引物探针组， 其包括： 如SEQ ID NO:7所示序列的上游引物、 如SEQ ID NO:8所示序列的下游引物、 和如SEQ ID NO:9所示序列的探针。 4.检测鲍曼不动杆菌的引物探针组， 其包括： 如SEQ ID NO:10所示序列的上游引物、 如SEQ ID NO:11所示序列的下游引物、 和如SEQ ID NO:12所示序列的探针。 5.根据权利要求1～4任一项所述的引物探针组， 其特 征在于， 如SEQ ID NO:3所示序列的探针的两端分别修饰荧 光基团FAM和淬灭基团BHQ1； 如SEQ ID NO:6所示序列的探针的两端分别修饰荧 光基团VIC和淬灭基团BHQ1； 如SEQ ID NO:9所示序列的探针的两端分别修饰荧 光基团ROX和淬灭基团BHQ2； 如SEQ ID NO:12所示序列的探针的两端分别修饰荧 光基团A425和淬灭基团BHQ1。 6.检测四种病原菌的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1～5任一项所述的引物探针 组。 7.根据权利 要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括RT ‑ddPCR检测试剂和 样品前处理 试剂， 所述样品前处 理试剂包括C helex裂解液。 8.非诊断目的检测四种病原菌的方法， 其特征在于， 以权利要求6或7所述的试剂盒对 样品进行检测， 所述样品为含有DNA和RNA的样品。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述检测的体系包括： 5×ddPCR Mix、 样品2μL、 引物各0.15μL， 探针各0.0375μL， 水补足15μL以及2 ×ddPCR  RT Mix 7.5 μL、 样品2 μL、 引物各0.15 μL， 探针各0.0 375 μL， 水补足 15 μL。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述检测的程序包括： 98℃5min， (98℃ 15s， 60℃60s)×40以及42℃3 0min， 98℃5mi n， (98℃15s， 6 0℃60s)×40。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592080 A 2检测四种病原菌的RT ‑ddPCR试剂 技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测技 术领域， 尤其涉及检测四种 病原菌的RT ‑ddPCR试剂。 背景技术 [0002]铜绿假单胞菌(Pseudomonas  aeruginosa)原称绿脓杆菌。 在自然界分布广泛， 为 土壤中存在的最常见的细菌之一。 经常引起术后伤口感染， 也可引起褥疮、 脓肿、 化脓性中 耳炎等。 本菌引起的感染病灶可导致血行散播， 而发生菌血症和败血症。 烧伤后感染了铜绿 色假单胞菌可造成死 亡。 [0003]大肠杆菌(Escherichia  coli)， 又叫大肠埃希氏菌， Escherich在1885年发现的。 大肠杆菌是条件致病菌， 在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多 种局部组织器官感染。 [0004]鲍曼不动杆菌(学名： Acinetob acter baumannii， 俗称： AB菌)， 又称鲍氏不动杆 菌， 属于革兰氏阴性菌， 是一种严格需氧、 非乳糖发酵的条件致病菌， 通常会引起菌血症， 肺 炎， 脑膜炎， 腹膜炎， 心内膜炎， 以及泌尿道和皮肤感染。 [0005]肺炎克雷伯菌(Klebsiella  Pneumoniae)是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的 一类菌(俗称肺炎杆菌)， 其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。 存在于人体上呼吸 道和肠道， 当机体抵抗力降低时， 便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变， 以上 叶较为多见。 [0006]铜绿假单胞菌、 大肠杆菌、 肺炎克雷伯菌、 鲍曼不动杆菌是临床上常见的致病菌， 在环境中存在也十 分的广泛， 现有技术中对治病菌的检测往往仅对样品的DNA进 行检测， 这 样可以提高检测的准确性， 但灵敏性往往不足， Chelex裂解产物为总核酸， 即同时包括DNA 和RNA， 对DNA和RNA同时检测可以提高检测的灵敏性， 但因Chelex裂解产物成分复杂， 对检 测的引物存在更高的要求。 发明内容 [0007]有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供以含有DNA和RNA的样品为对象， 检 测四种病原菌的RT ‑ddPCR试剂。 [0008]本发明提供了检测铜绿假单 胞菌的引物探针组， 其包括： [0009]如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、 [0010]如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、 [0011]和如SEQ ID NO:3所示序列的探针。 [0012]其中， 如SEQ  ID NO:3所示序列的探针的两端分别修饰荧光基团FAM和淬灭基团 BHQ1。 [0013]本发明提供了检测大肠杆菌的引物探针组， 其包括： [0014]如SEQ ID NO:4所示序列的上游引物、 [0015]如SEQ ID NO:5所示序列的下游引物、说　明　书 1/6 页 3 CN 114592080 A 3