(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210372321.9 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 上海近则生物科技有限责任公司 地址 201100 上海市浦东 新区中国 （上海） 自由贸易试验区临港新片区新杨公路 860号10幢 (72)发明人 付洁　白宗良　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与宫颈癌相关的微卫星位点及其检测 引物 (57)摘要 本申请公开了与宫颈癌相关的微卫星位点， 包括BAT26微卫星位点、 D6S2447微卫星位点、 D ‑ loop区微卫星位点、 NR24微卫星位点， 本发明进 一步公开了扩增上述微卫星位点的检测引物， 以 及采用所述引物建立了一种用于检测上述微卫 星位点的荧光定量PCR方法， 该方法的检测灵敏 度可以达到每微升拷贝数为10的模板进行扩增， 本发明进一步公开了石蜡包埋切片组织的DNA提 取方法， 提取的DNA可以直接应用于本发明的荧 光定量PCR方法。 采用本发明的引物可以用于检 测宫颈癌患者中微卫星位点的突变情况， 对于宫 颈癌的辅助诊断以及进一步的治疗预后具有重 要的意义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表4页 附图2页 CN 115261466 A 2022.11.01 CN 115261466 A 1.一种与宫颈癌相 关的微卫星位点组合物， 其特征在于， 所述组合物包括： 包括BAT26 微卫星位点的核苷 酸， 包括D6S2447微卫星位点的核苷 酸， 包括线粒体基因D ‑loop区微卫星 位点的核苷酸， 包括 NR24微卫星位点的核苷酸。 2.一种用于检测宫颈癌相关的微卫星位点的引物组合物， 其特征在于， 所述引物组合 物包括： 检测BAT26微卫星位点的引物， 检测D6S2447微卫星位点的引物， 检测线粒体基因D ‑ loop区微卫星位点的引物， 检测NR24 微卫星位点的引物。 3.根据权利要求2所述的引物组合物， 其特征在于， 检测BAT26微卫星位点的引物分别 如SEQ ID NO： 1和2所示， 检测D6S2447微卫星位点的引物分别如SEQ  ID NO： 3和4所示， 检测 线粒体基因D ‑loop区微卫星位点的引物分别如SEQ  ID NO： 5和6所示， 检测NR24微卫星位点 的引物分别如SEQ  ID NO： 7和8所示。 4.根据权利要求3所述的引物 组合物， 其特征在于， 所述引物组合物还包括内参位点引 物。 5.根据权利要求 4所述的引物组合物， 其特 征在于， 所述引物采用荧 光基团进行 标记。 6.根据权利要求5所述的引 物组合物， 其特征在于， 所述荧光基团选自： FAM、 HEX、 TET、 JOE、 TAM、 NED、 VIC、 C Y3、 CY5、 ROX或TAMRA。 7.一种用于检测与宫颈癌相关的微卫星位点的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 权利要求1所述的组合物和/或权利要求2 ‑6任一权利要求所述的引物组合物。 8.一种检测微卫星不稳定性的方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： 采用如权利 要求1‑6任一项所述的组合物， 或如权利要求7所述的试剂盒， 对待测DNA进行荧光定量PCR 和毛细管电泳， 根据结果判断微 卫星不稳定性的状态。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， DNA来源于病理组织、 石蜡包埋切片组织、 肿瘤细胞或外周血中的任意 一种。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述石蜡包埋切片组织的DNA提取的步骤 如下： (1)向装有组织的EP管中加入1.0mL二甲苯溶剂， 振荡器充分振荡， 60℃水浴保温 15min， 室温离心5min， 移走上清液， 加入无水乙醇， 振荡器充分振荡， 室温离心5min (12000r/min)， 弃上清液。 重复上述步骤一次。 打开离心管盖子， 3 7℃保温10～15min。 (2)加 入200mL细胞裂解液， 振荡至彻底悬浮， 加入40 μL蛋白酶K溶液， 充分混匀。 56℃水浴箱放置 8h， 每小时颠倒混匀样品2～3次， 直至组织完全 溶解。 (3)加入200 μL  PB缓冲液， 充分颠倒混 匀， 70℃放置10min至溶液变清亮， 加 入250 μL无水乙醇， 充分振荡混匀， 将离心管内溶液及 絮状沉淀加入吸附柱内(吸附柱 放入收集管中)， 12000rpm离心1min， 倒掉收集管中的废液， 吸附柱放回收集管， 向吸附柱中加入500 μL  TE缓冲液， 12000rpm离心1min， 倒掉收集管中的 废液， 吸附柱放回收集管， 向吸附柱中加入700 μL异丙醇， 12000rpm离心1min， 倒掉收集管中 的废液， 吸附柱 放回收集管， 向吸附柱中加入500 μL无水乙醇， 重复上一步骤， 将吸附柱放回 收集管， 12000rpm离心5min， 吸附柱置于室温15min， 吸附柱转入一个干净的1.5mL离心管 中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加15 0 μL TE洗脱液， 室温放置 5min， 12000rpm离心1mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261466 A 2一种与宫颈癌相关的微卫星位点 及其检测引物 技术领域 [0001]本发明涉及基 因检测领域， 尤其涉及一种与宫颈癌相关的微卫星位点及其检测引 物。 背景技术 [0002]微卫星是遍布于人类基因的短串联重复序列， 高度可变， 在真核生物基因组中无 处不在。 由于高度可变性， 微卫星在人群中趋于变化， 因此被广泛用作分子标记、 连锁作图、 谱系作图和基因型鉴定的目的。 [0003]当其发生突变、 丢失的时候， 主要通过DNA错配修复系统(Mismatch  repair， MMR) 来修复。 如果MMR基因发生失活， 引起DNA错配修复功能缺陷， 导致细胞修复错配碱基的功能 降低或缺失， 会产生 微卫星不稳定(MSI)， 这种机制广泛 存在于各种癌症中。 [0004]MSI在结肠癌中， 可作为遗传性非息 肉病性结直肠癌的诊断依据之一。 因MSI表型 实体瘤会在选择性高度上调包括PD ‑1、 PD‑L1、 CTLA‑4等多个免疫检查点的表达， 故而亦是 免疫检查 点抑制剂的适应症， 也是晚期转移性结肠癌的用药指征。 [0005]目前， 对于宫颈癌相关的微卫星位点的研究并不多见， 而进一步发掘与宫颈癌相 关的微卫星位点， 对于宫颈癌的临床辅助诊断具有新的意义， 也对宫颈癌的进一步用药治 疗提供新的思路。 发明内容 [0006]为了解决目前宫颈癌相关微卫星位点研究不足的情况， 本发明提供如下技术方 案。 [0007]本发明公开了一种与宫颈癌相关的微卫星位点组合物， 所述组合物包括： 包括 BAT26微卫星位点的核苷酸， 包括D6S2447微卫星位点的核苷酸， 包括线粒体基因D ‑loop区 微卫星位点的核苷酸， 包括 NR24微卫星位点的核苷酸。 [0008]本发明公开了一种用于检测宫颈癌相关的微卫星位点的引物组合物， 所述引物组 合物包括： 检测BAT26微卫星位点的引物， 检测D6S2447微卫星位点的引物， 检测线粒体基因 D‑loop区微卫星位点的引物， 检测NR24 微卫星位点的引物。 [0009]优选的， 检测BAT26微卫星位点的引物分别如SEQ  ID NO： 1和2所示， 检测D6S2447 微卫星位点的引物分别如SEQ  ID NO： 3和4所示， 检测线粒体基因D ‑loop区微卫星位点的引 物分别如SEQ  ID NO： 5和6所示， 检测NR24 微卫星位点的引物分别如SEQ  ID NO： 7和8所示。 [0010]优选的， 所述SEQ  ID NO： 1和2的序列分别为ccagtat  atgaaattgga和 tttaaccattcaacattt。 [0011]优选的， 所述SEQ  ID NO： 3和4的序列分别为actctggtagacattctaga和 tgcatttctcttccttatcac。 [0012]优选的， 所述SEQ  ID NO： 5和6的序列分别为cactccca  tactactaat和 ctgtggggggtgtctttgg。说　明　书 1/7 页 3 CN 115261466 A 3