(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210339035.2 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 上海睿璟生物科技有限公司 地址 201112 上海市闵行区召楼路3 632号2 幢5层 (72)发明人 石涵　龚伟　高伙妮　 (74)专利代理 机构 北京汇众通达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11622 专利代理师 尹全杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于 数字RCR的人肺癌GF RT790M突变检 测方法及其检测方法 (57)摘要 本发明公开了基因突变检测领域的一种基 于数字RCR的人肺癌GFRT790M突变检测方法， 包 括核酸扩增试剂和对照品， 所述核酸扩增试剂 包 括EGFRT790M反应液， 所述反应液中含有用于检 测EGFR基因T790M突变的特异性引物和荧光探 针， 所述反应液中还包含一对上游引物和下游引 物以及MGB荧光探针； 所述核 酸扩增试剂 还包括2 ×QuantStudio3DDigitalPCRMix。 本发明还公开 了上述检测EGFR基因T790M突变的PCR试剂盒的 检测方法的检测方法。 本申请的试剂盒采用数字 PCR技术， 可对非小细胞肺癌患者组织或血浆DNA 样本中的T790M突变进行定量检测， 从而辅助患 者的靶向用药治 疗方案的制定 。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114574586 A 2022.06.03 CN 114574586 A 1.一种基于数字RCR的人肺癌EGFR  T790M突变检测方法， 其特征在于， 所述突变检测方 法采用T790M突变的PCR试剂盒,T790M突变的PCR试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品， 所述 核酸扩增试剂包括反应液， 所述反应液中含有用于检测EGFR基因T790M突变的特异性引物 和荧光探针， 所述特异 性引物还包含一对 上游引物和下游引物， 所述荧光探针为M GB荧光探 针， 所述M GB荧光探针还包括野生型探针和突变型探针； 所述特异 性引物和荧光探针的序列 与修饰如下： 上游引物5 ’ ‑ACGTGTGC CGCCTGCT‑3’ 下游引物5 ’ ‑TTGTGTTCCCGGACAT‑3’ 野生型探针5 ’ ‑FAM‑TCATCACGCAGCTC ‑MGB‑3’ 突变型探针5 ’ ‑FAM‑TCATCATGCAGCTC ‑MGB‑3’； 所述核酸扩增试剂还 包括2×QuantStudi o 3D Digital PCR Mix。 2.根据权利 要求1所述的一种基于数字RCR的人肺癌 EGFR T790M突变检测方法， 其特征 在于， 所述反应液中包 含的特异性引物含量 为900nmol/L， 荧光探针含量 为250nmol/L。 3.根据权利 要求1所述的一种基于数字RCR的人肺癌 EGFR T790M突变检测方法， 其特征 在于， 所述QuantStudio  3D Digital PCR Mix为2×工作液， 配制时加入量为总体系量的一 半。 4.根据权利要求1 ‑3任一所述的一种基于数字RCR的人肺癌 EGFR T790M突变检测方法， 其特征在于， 所述对照品还 包括阳性对照和阴性对照。 5.根据权利 要求4所述的一种基于数字RCR的人肺癌 EGFR T790M突变检测方法， 其特征 在于， 所述阴性对照为工艺用水， 所述阳性对照为 突变质粒和野生型质粒混合物。 6.根据权利 要求5所述的一种基于数字RCR的人肺癌 EGFR T790M突变检测方法， 其特征 在于， 所述 突变质粒 所包含的EGFR基因片段序列如下： GCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATG GCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCA GCTCATCATGCA GC TCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCA GTACCTGCTCAACTG GTGTGTGCAGATCGCA AAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACG GGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGC 。 7.基于如权利要求1 ‑6任一所述的一种基于数字RCR的人肺癌EGFR  T790M突变检测方 法， 其特征在于， 包 含步骤如下： (1)根据不同样本类型选择相应商业DNA提取 试剂盒进行DNA的提取， 作为检测的模板； (2)配制EGFR  T790M检测3D数字PCR反应 体系， 体系包 含： (3)使用芯片上样仪， 将上述反应 体系取14.5 μL均匀分布到PCR芯片上； (4)将芯片放置 到PCR仪上进行扩增， 扩增程序为： (5)扩增完成， 取 出芯片； 将芯片放置 到芯片读取仪内进行扫描； (6)扫描结束， 将数据上传至服 务器， 划定阈值完成结果的分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574586 A 2一种基于数字RCR的 人肺癌GFRT790M突变检测方 法及其检测 方法 技术领域 [0001]本发明涉及 基因突变检测领域的一种基于数字 RCR的人肺癌EGFR  T790M突变检测 方法。 背景技术 [0002]肺癌一直以来位居全球癌症相关死亡首位。 美国癌症协会发布的数据显示， 2014 年全美新 发肺癌22 4210例， 位居癌症第二位， 其中非小细胞肺癌占8 0％。 尽管化疗 取得了一 些进步， 但目前以铂类为基础的最有效化疗方案的中位生存时间也不会超过10个月。 近年 来， EGFR络氨酸激酶抑制剂(EGFR ‑TKI)的广泛应用使非小小细胞肺癌的治疗获得很大进 步。 目前第一代EGFR络氨 酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼广泛应用于NSCLC的治疗。 它们 可逆地与ATP结合 位点结合， 从而阻止 了EGFR下游通路的激活。 [0003]虽然在EGFR‑TKI使用之初效果显著， 但是多数患者最终都会在使用后9 ‑10个月发 生耐药或病情进展。 在2005年对于EGFR ‑TKI耐药患者的病例分析中首次提到了T790M突变。 耐药后标本的20外显子上密码子790中的C到T碱基的突变使得相应苏氨酸(T)被甲硫氨酸 (M)取代， 此关键位置的氨基酸的改变使得已有的L858R突变的激酶结构域对ATP亲和力反 超EGFR‑TKI， 使EGFR ‑TKI在和ATP的竞争中处于弱势而无法继续阻断EGFR的信号通路， 即表 现为耐药或疾病进 展。 [0004]最近几年， 针对该突变的以奥希替尼为代表的第三代TKI进入大家的视线， 由于其 临床疗效及可耐受的毒副作用， FDA加速审 批， 批准其可作为一代T KI耐药后的治疗 策略。 奥 希替尼一种不可逆的三代EGFR ‑TKI， 可以选择性地抑制EGFR敏感突变和T790M突变。 2017年 3月， 奥希 替尼在华上市， 开创了EGFR ‑TKI耐药后T790M阳性患者的精 准治疗新时代。 随着该 药物的上市， 如何敏感、 准确地检测T790 M突变成为临床关注的热点。 [0005]《2016年的晚期原发性肺癌诊治专家共识》 建议有条件的患者在疾病进展时应再 次进行肿 瘤组织活检， 并进行病理和相关 的基因检测以明确耐药的性质。 目前， T790M检测 方法主要包 括：①扩增阻滞突变系统法(amplified  refractory  mutation  system， ARMS)； ②聚合酶链式反应(polymerase  chain reaction， PCR)； ③二代测序法(next ‑ generationsequencing， NGS)。 ARMS法只能检测已知突变， 方便快捷、 特异度高， 在临床广泛 应用； 而NGS是近年发展起来的高通量深度测序技术群， 可一次性对几百万条至十亿条DNA 分子进行并行测序， 但对稀有突变及结构 变异不敏感且价格昂贵， 广泛应用仍受到限制。 在 标本选择上可有： 组织、 恶性胸水及血液， 临床中多因组织获取困难， 更多选择液体活检， NCCN等多项指南已经推荐使用NGS进行液体检测。 Oxnard等研究指出， 一代TKI治疗后失败 的NSCLC患者若检测出T790M突变阳性患者的进展后生存期显著长于无T790M突变患者。 因 此， T790M突变既是EGFR ‑TKI耐药的原因之一， 也因为其可选择三代TKI进行后续治疗而因 此成为进展后生存的良好预后因子。 动态检测T790M突变可能预测未来的耐药， 可以进一步 探究T790M突变诱导的耐药机制， 并指导进展期NSCLC患者的治疗， 但其中细则问题 需要更说　明　书 1/4 页 3 CN 114574586 A 3