(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210356992.6 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 深圳市国赛 生物技术有限公司 地址 518000 广东省深圳市南 山区招商街 道科技大厦103C、 503C、 504D;科技大 厦辅楼3A号、 4A号 (72)发明人 薛丽丽　郑筱雯　陈明峰　 (74)专利代理 机构 深圳市恒程创新知识产权代 理有限公司 4 4542 专利代理师 孔德丞 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合 及其试剂盒 (57)摘要 本发明提供一种检测肠道病毒71型的引物 和探针组合及其试剂盒， 所述检测肠道病毒71型 的引物和探针组合包括根据筛选出的高度保守 序列设计的EV71上游引物， EV71下游引物， 及 EV71探针， 所述探针的核苷酸序列如SEQID  NO： 3 所示。 本发明中， 通过基于肠道病毒71型高度保 守序列筛选出的引物与探针组合， 和可能存在同 源性序列、 其他肠道病毒、 其他病原体等无交叉 反应， 具有很好的特异性； 同时， 通过包含其的引 物和探针组合的试剂盒检测肠道病毒7 1型， 检测 操作快速、 方法简便、 检测灵敏度高、 检测范围 宽， 可以在较 短的时间内对粪便等未知样本中的 EV71RNA进行快速准确的检测， 为诊断肠道病毒 71型感染提供可靠的实验依据。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图7页 CN 114672594 A 2022.06.28 CN 114672594 A 1.一种检测肠道病毒71型的引物和探针组合， 其特征在于， 所述检测肠道病毒71型的 引物和探针组合包括： EV71上游引物， 所述EV71型 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示； EV71下游引物， 所述EV71型 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； 及， EV71探针， 所述探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示。 2.如权利 要求1所述的检测肠道病毒71型的引物和探针组合， 其特征在于， 所述EV71探 针的5’端标记有荧 光基团， 3 ’端标记有荧 光淬灭基团。 3.如权利要求2所述的检测肠道病 毒71型的引物和探针组合， 其特征在于， 所述荧光基 团选自FAM、 VIC、 ROX或C Y5中的任意 一种； 和/或， 所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2中的一种。 4.如权利要求1所述的检测肠道病 毒71型的引物和探针组合， 其特征在于， 所述检测肠 道病毒71型的引物和探针组合还 包括： 内标上游引物， 所述内标 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示； 内标下游引物， 所述内标 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示； 及， 内标探针， 所述内标探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 6所示。 5.一种检测肠道病毒71型的试剂盒， 其特征在于， 所述检测肠道病毒71型的试剂盒包 括EV71反应液、 DNA聚合酶及逆转录酶， 其中， 所述EV71反应液包括PCR反应缓冲液、 dNTPs及 如权利要求1～4所述的检测肠道病毒71型的引物和探针组合。 6.如权利要求5所述的检测肠道病 毒71型的试剂 盒， 其特征在于， 所述检测肠道病毒71 型的试剂盒还 包括阴性对照品和阳性对照品。 7.如权利 要求5或6所述检测肠道病毒71型的试剂盒， 其特征在于， 所述EV71反应液中， 所述PCR反应缓冲液的含量 为2.5～5 μL； 和/或， 所述EV71反应液中， 所述dNTPs的浓度为0.1～0.5 μM； 和/或， 所述EV71反应液中， 所述EV71上游引物的浓度为0.1～1 μM； 和/或， 所述EV71反应液中， 所述EV71上游引物的浓度为0.1～1 μM； 和/或， 所述EV71反应液中， 所述EV71探针的浓度为0.1～1 μM； 和/或， 所述DNA聚合酶为Taq酶； 和/或， 所述DNA聚合酶的活性 为0.5～2U； 和/或， 所述逆转录酶的活性 为1～10U。 8.如权利要求5所述的检测肠道病 毒71型的试剂 盒， 其特征在于， 所述检测肠道病毒71 型的引物和探针组合还包括核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示的内标上游引物， 核苷酸序列 如SEQ ID NO： 5所示的内标 下游引物及核苷酸序列如SEQ  ID NO： 6所示的内标探针； 和/或， 所述dNTPs包括dATP、 dU TP、 dGTP及dCTP； 和/或， 所述检测肠道病毒71型的试剂盒还 包括内标质粒。 9.如权利要求8所述的检测肠道病 毒71型的试剂盒， 其特征在于， 所述内标质粒包括果 蝇靶序列； 和/或， 所述内标 上游引物的浓度为0.1～1 μM； 和/或， 所述内标 下游引物的浓度为0.1～1 μM； 和/或， 所述内标探针的浓度为0.1～1 μM 。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114672594 A 210.一种检测肠道病毒71型的方法， 其特征在于， 所述检测肠道病 毒71型的方法包括以 下步骤： 获取待检测样品； 将所述检测样品、 阴性对照品及阳性对照品采用如权利要求6～9任一项所述的试剂 盒 进行PCR反应； 根据PCR反应的扩增结果判定所述待检测样品的是否存在 肠道病毒71型。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114672594 A 3