(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210349607.5 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100020 北京市朝阳区北辰西路一 号 院2号 (72)发明人 黄勋　王海涛　刘秋月　马润林　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 苏士莹 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 一种编辑绵羊SOCS2 基因的sgRNA组合、 扩增 用引物和应用 (57)摘要 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一 种高效编辑绵羊SOCS2 基因的sgRNA组合、 扩增用 引物和应用。 利用本发明的sgRNA组合制备Cas9 载体， 可针对SOCS2 基因进行编辑， 实施例结果表 明不同单克隆细胞基因组中造成不同程度编辑， 包括大片段(52或53bp敲除)、 点突变(G突变为 C)、 小片段敲除(9或11bp敲除)， 对SOCS2蛋白结 构造成极大影 响， 在目标区域的总体编辑效率达 到82.9％， 双等位基因上均发生编辑效率为 51.2％。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 CN 114574493 A 2022.06.03 CN 114574493 A 1.一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合， 其特 征在于， 包括Sosg1和Sosg2； 所述Sosg1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述Sosg2的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2 所示。 2.一种用于扩增权利要求1所述sgRNA组合的引物， 其特征在于， 所述引物包括核苷酸 序列如SEQ  ID NO.3所示的正向引物Sosg1 ‑F， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的反 向引物 Sosg1‑R； 核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的正向引物So sg2‑F和核苷酸序列如SEQ  ID NO.6 所示的反向引物Sosg2 ‑R。 3.一种包含权利要求1所述sgRNA组合的重组载体， 其特征在于， 所述重组载体的出发 载体包括pX3 30载体。 4.根据权利要求3所述的重组载体， 其特征在于， 所述重组载体的基础载体包括pX330 载体。 5.权利要求1所述sgRNA组合、 权利要求2所述引物或权利要求3或4所述重组载体在敲 除绵羊SOCS2基因或在改善绵羊生长性能中的应用。 6.一种编辑绵羊SOCS2基因的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将Sosg1‑F和Sosg1‑R退火得Sosg1； 将S osg2‑F和Sosg2‑R退火得Sosg2； 所述Sosg1 ‑F的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述Sosg1 ‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， 所述 Sosg2‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， 所述Sosg2 ‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所 示； 将Sosg1和Sosg2分别插 入pX330载体中， 得到 重组载体pX3 30‑Sosg1和pX3 30‑Sosg2； 将所述重组载体pX330 ‑Sosg1、 pX330 ‑Sosg2及抗性载体共转绵羊细胞， 培养得单克隆 细胞。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述插 入位点包括BbsI。 8.根据权利要求6所述 的方法， 其特征在于， 所pX330 ‑Sosg1、 pX330 ‑Sosg2和抗性载体 的质量比为1： 1： 1； 所述抗性载体包括G418抗 性载体pl 452。 9.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 得单克隆细胞后， 还包括利用SOCS2F1和 SOCS2F2验证基因敲除效果， 所述SOCS2F1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示； 所述SOCS2F2 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示。 10.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述绵羊细胞包括绵羊胎儿成纤维细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574493 A 2一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、 扩增用引物和应用 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种高效编辑绵羊SOCS2基因的s gRNA组 合、 扩增用引物和应用。 背景技术 [0002]Sg(single ‑guide， 单链引导)序列为利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时设计 的靶向目标基因的序列， sg序列位置的设计对其编辑靶基因的效率有影响， 使用高编辑效 率的sg序列更容易获得基因编辑的细胞或受精卵， 可为 获得基因编辑细胞或动物个体减少 实验时间及成本。 在CRISPR/Cas9技术出现之前， 通常利用同源重组、 ZFN(锌指核酸酶)、 TANLEN(转录激活样效应核酸 酶)等技术 实现目的基因的大片段精确敲除。 但细胞内 自然发 生同源重组的效率极低(10‑6)， CRISPR/Cas9技术的出现大大提 高了基因编辑的发生效率， 并可以高效的介导同源重组， 相比于ZFN和TALEN， Cas9编辑的效率更高。 [0003]SOCS2(Suppressors  of cytokine  signaling  2)基因即细胞信号转导抑制因子 2， 与动物生长发育调控相关， 在绵羊 中， SOCS2基因是与生长速度与体型大小相关的重要候 选基因， 对该基因进行编辑有助于获得生长更快， 体型更大 的绵羊新品系。 目前， 未见有高 效的编辑SOCS2基因的sg序列的报导。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合、 扩增用引物和应 用， 高效编辑绵羊SOCS2基因， 验证SOCS2基因敲除对绵羊生长发育的影响， 为培育生长性能 的绵羊品种提供依据。 [0005]本发明提供了一种编辑绵羊SOCS2基因的sgRNA组合， 包括Sosg1和Sosg2； [0006]所述Sosg1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述Sosg2的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2所示。 [0007]本发明还提供了一种用于扩增上述技术方案所述sgRNA组合的引物， 所述引物包 括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的正向引物Sosg1 ‑F， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的 反向引物Sosg1 ‑R； 核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的正向引物Sosg2 ‑F和核苷酸序列如SEQ   ID NO.6所示的反向引物Sosg2 ‑R。 [0008]本发明还提供了一种包含上述技术方案所述sgRNA组合的重组载体， 所述重组载 体的出发载体包括pX3 30载体。 [0009]优选的， 所述重组载体的基础载体包括pX3 30载体。 [0010]本发明还提供了上述技术方案所述sgRNA组合、 上述技术方案所述引物或上述技 术方案所述重组载体在敲除绵羊SOCS2基因或在改善绵羊生长性能中的应用。 [0011]本发明还提供了一种编辑绵羊SOCS2基因的方法， 包括以下步骤： [0012]将Sosg1 ‑F和Sosg1 ‑R退火得Sosg1； 将Sosg2 ‑F和Sosg2 ‑R退火得Sosg2； 所述 Sosg1‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述Sosg1 ‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所说　明　书 1/7 页 3 CN 114574493 A 3