(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210344663.X (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 山东中农天泰种业有限公司 地址 273300 山东省临沂市平邑县银花路 南文化路西侧 申请人 齐鲁师范学院　 海南省农业科 学院三亚研究院 （海 南省实验动物研究中心） (72)发明人 路小铎　刘宁　王敏　秦莉　 刘西美　石绪海　张春义　侯本军　 柴振光　 (74)专利代理 机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 3710 5 专利代理师 韩百翠(51)Int.Cl. C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 6/46(2018.01) A01H 5/10(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一个与玉米籽粒支链淀粉含量相关的dCAPS 分子标记 (57)摘要 本发明公开了一个与玉米籽粒支链淀粉含 量相关的dCAPS分子标记。 相比野生型， waxy1 ‑2 突变体中waxy1基因在第10个外显子上发生了C →T单碱基突变， 导致第431位氨基酸由谷氨酸 Gln变为终止密码子， waxy1 ‑2突变体的支链 淀粉 含量为97.1％， 对应野生型的支链淀粉含量为 78.99％。 针对上述单碱基突变， 本发明设计了 dCAPS分子 标记， 能够快速鉴定waxy1基因单碱基 突变， 为分子标记辅助选择育种提供新的靶标， 可以大大缩短育种周期。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 CN 114591928 A 2022.06.07 CN 114591928 A 1.一种与玉米籽粒支链淀粉含量相关的waxy1 ‑2突变体， 其特征是， 相比野生型， waxy1‑2突变体中waxy1基因在第10个外显子上发生了C →T单碱基突变， 导致第431位氨基 酸由谷氨酸Gln变为终止密码子， waxy1 ‑2突变体的支链淀粉含量≥95％， 突变位点处相关 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.如权利要求1所述的waxy1 ‑2突变体在培育玉米高支 链淀粉新品种方面的应用。 3.一个与玉米籽粒支链淀粉含量相关的dCAPS分子标记， 其特征是， 与玉米籽粒支链淀 粉含量野生型基因Waxy1 ‑2检测相关的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 与玉米籽粒支链淀 粉含量突变体基因waxy1 ‑2检测相关的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 4.权利要求3所述的dCAP S分子标记在糯玉米遗传育种中的应用。 5.权利要求3所述的dCAP S分子标记的特异引物， 其引物序列为： dCAPS‑F： 5’ ‑GTCATGGCGGCCGCCATCCCGCAGCTCATG GAGATGGTGGAGGACGTC‑3’； dCAPS‑R:5’ ‑GACCACGGCGCGCAC CTTGC‑3’。 6.权利要求3所述的dCAPS分子标记或者权利要求5所述的特异引物在鉴定玉米籽粒支 链淀粉含量waxy1‑2突变基因型和野生型中的应用。 7.一种鉴定玉米籽粒支 链淀粉含量waxy1‑2突变基因型和野生型的方法， 其特 征是， (1)以待测玉米材料的基因组DNA为模板， 以SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4所示的特异性 引物进行PCR扩增； (2)对步骤(1)得到 的PCR产物进行限制性内切酶XbaI酶切， 然后利用琼脂糖凝胶电泳 进行分离； 若所得酶切产物仅有235bp的DNA片段， 则待测玉米材料为具有Waxy1 ‑2野生基因型且 支链淀粉含量低的非糯性材 料； 若所得酶切产物为大小187bp和47bp的两个DNA片段， 则待测玉米材料为具有waxy1 ‑2 突变基因型且支 链淀粉含量高的糯性材 料； 若所得酶切产物为235bp、 187bp和 47bp三个DNA片段， 则待测玉米材料为具有waxy1 ‑2 杂合基因型且支 链淀粉含量低的非糯性材 料。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征是， PCR扩增采用的PCR体系为： 10μmol/L的正反向 引物各1 μL， 基因组DNA  1 μL， EasyTaq  DNA聚合酶0.2 μL， buffer  2.5 μL， dNTPs  2 μL， ddH2O补 足至25 μL。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征是， PCR扩增采用的PCR反应程序为： 95℃预变性 5min； 95℃变性30s， 56℃退火30s， 72℃延伸 30s， 共35个循环； 72℃过度延伸 5min； 16℃保 存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114591928 A 2一个与玉米籽粒支链淀 粉含量相关的dCAPS分子标记 技术领域 [0001]本发明涉及 植物分子生物学技术领域， 具体涉及 一个与玉米籽粒支链淀粉含量相 关的dCAP S分子标记。 背景技术 [0002]玉米长期 以来都是人类生存的基本食物来源， 主要的动物饲料及重要的工业原 料。 普通玉米籽粒中的淀粉由直链淀粉(约25％)和支链淀粉(75％)组成， 而糯玉米籽粒几 乎不含直链淀粉， 全由支链淀粉组成。 糯玉米是重要的鲜食玉米， 具有良好口感和很高的营 养价值， 糯玉米还是生产支 链淀粉的重要基础原料。 [0003]糯玉米的糯性特征 由waxy1(wx1)基因的隐性突变控制， waxy1基因编码颗粒结合 淀粉合成酶(GBSSI)， 该酶是合成直链淀粉所必须的酶。 waxy1基因序列位于9号染色体上， 由14个外显子和13个内含子组成， 序列全长3.93Kb。 如果waxy1基因缺失、 表达受阻或GBSSI 酶活性降低， 直链淀粉合 成受阻， 导致糯性的表型。 目前已发现50个waxy1等位基因， 主要包 括大部分不稳定遗传的转座子插入的糯性突变和 一些能稳定遗传的碱基替换和插入缺失 的糯性突变。 虽然已经有众多的waxy1等位基因， 但是利用新的种质资源， 寻找新的糯性基 因， 对于丰富糯性玉米调控基因库具有重要的理论和实 践意义。 [0004]申请人前期从实验室构建的玉米EMS突变体库(MEMD， http: //elabcaas.cn/memd/ public/)中对waxy1基因相关的突变位点进行筛选， 发现一个突变体中waxy1基因在第10个 外显子上发生了C →T单碱基突变， 导致第431位氨基酸由谷氨酸Gln(密码子Cag)变为终止 密码子(Tag)， 该突变体命名为waxy1 ‑2， waxy1‑2突变体的支链淀粉含量为97.1％， 对应野 生型的支链淀粉含量为78.99％。 可以通过将该突变基因导入到优良自交系中获得高支链 淀粉含量的糯玉米， 从而加快糯玉米的育种和改良。 发明内容 [0005]申请人前期从实验室构建的玉米EMS突变体库(MEMD， http: //elabcaas.cn/memd/ public/)中对waxy1(Zm00001d045462)基因相关的突变位点进行筛选， 发现一个突变体中 waxy1基因在第10个外显子上发生了C →T单碱基突变， 导致第431位氨基酸由谷氨 酸Gln(密 码子Cag)变为终止密码子(Tag)， 该突变体命名为waxy1 ‑2， waxy1‑2突变体的支链淀粉含量 为97.1％， 对应野生型的支 链淀粉含量为78.99％。 [0006]本发明首先提供一种与 玉米籽粒支链淀粉含量相关的waxy1 ‑2突变体， 其特征是， 相比野生型， waxy1 ‑2突变体中waxy1基因在第10个外显子上发生了C →T单碱基突变， 导致 第431位氨基酸由谷氨酸Gln(密码子Cag)变为终止密码子(Tag)， waxy1 ‑2突变体的支链淀 粉含量≥95％， 突变位 点处相关的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 [0007]本发明还提供了一个与玉米籽粒支 链淀粉含量相关的dCAP S分子标记， 其特 征是， [0008]与玉米籽粒支链淀粉含量野生型基因Waxy1 ‑2检测相关的核苷酸序列如下(SEQ   ID NO.1,加粗下划线碱基为单核苷酸 位点变异SNP)：说　明　书 1/4 页 3 CN 114591928 A 3