(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210352261.4 (22)申请日 2022.04.05 (71)申请人 吉林省农业科 学院 地址 130018 吉林省长 春市净月高新 开发 区生态大街13 63号 (72)发明人 林春晶　彭宝　段玥彤　张春宝　 闫昊　张井勇　丁孝羊　王鹏年　 赵丽梅　张伟　 (74)专利代理 机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 2 2100 专利代理师 陈宏伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种dCAPS标记区分异交率大豆雄性不育系 的方法 (57)摘要 本发明提供了一种dCAPS标记区分异交率大 豆雄性不育系的方法， 用于鉴定大豆细胞质雄性 不育系异交率的高或者低， 将为拓宽大豆CMS种 质资源和鉴别高异交率和低异交率不育系提供 方便快捷的途径。 从高异交率的不育系和低异交 率不育系中发现存在的差异SNP， 在跨SNP的区域 侧翼序列设计引物进行PCR扩增， 扩增的产物片 段大小通过限制性内切酶酶切可以将高异交率 的雄性不育系和低异交率不育系区分出来， 条带 清晰， 重复性好， 可靠性强， 这种应用基于SNP和 内切酶结合的标记可以鉴定出育种过程中高异 交率的不育系， 为制种过程中高效的选择母本， 降低制种成本提供保障。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 114959091 A 2022.08.30 CN 114959091 A 1.一对用于dCAPS标记区分高异交率大豆雄性不育系方法的引物， 其特征在于采用 dCAPS分子标记SNP1进行PCR扩增对应的引物： 上游引物序列： 5 ’ ‑  ACAGCGACA AAGTAATGGGTCAAGCT  ‑3’； 下游引物序列： 5 ’ ‑  TCTCCAAGATTGACGACGA AGG  ‑3’。 2.一种dCAP S标记区分高、 低异交率大豆雄 性不育系的方法， 其 步骤详细阐 述如下： 1） 提取RN型细胞质雄性不育系组织 的基因组DNA， 此DNA作为PCR扩增模板， 采用dCAPS 分子标记SNP1进行PCR扩增， 对应的引物为： 上游引物序列为： 5 ’ ‑ACAGCGACA AAGTAATGGGTCAAGCT‑3’； 下游引物序列为： 5 ’ ‑  TCTCCAAGATTGACGACGA AGG  ‑3’； 2） 进行PCR扩增， 体系为25 μL， 其中2 ×PCR MIX 12.5 μL， 上下游引物各1 μL （10 μM  / μL） ， 模板DNA (10～20 ng/ μL) 4 μL， 无菌去离子水6.5 μL； PCR循环条件为94℃预变性3  min； 94 ℃变性30 s， 56℃复性 30 s， 72℃延伸  40 s， 35个循环； 72℃延伸5  min； 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物， 成像并记录条 带大小； 此PCR产物作为酶切模板； 3） 进行PCR产物酶切： 所述的dCAPS标记SNP1对应的酶切体系为20μL， 其中加入1μL的HindIII； 加入1μL的10 倍CutSmart  buffer， PCR产物5 μL， 加入3 μL  ddH2O； 酶切反应程序为3 7℃孵育15min， 然后80 ℃孵育20min将酶失活； 4） 利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物： 琼脂糖凝胶电泳过程： 将酶切产物 10 μL混入2 μL的10 ×溴酚蓝上样缓冲液， 然后在配制 浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳， 100V电压， 电泳时间为40  min； 在凝胶成像仪上记录并分析电 泳结果； 成像并记录条带数量和大小； 通过获得不同数量和长度大小的条带进行大豆RN型 细胞质雄性不育系的异交率高、 低的区分； 高异交率不育系的酶切片段长度为302bp， 低异 交率不育系的酶切片段为三个， 长度 分别为302bp、 279bp和23bp； 其中23bp因为分子量小， 在琼脂糖凝胶电泳中肉眼观测不出来， 能在琼脂糖凝胶电泳上被肉眼观察到的片段为两 个， 分别是3 02bp和279bp。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959091 A 2一种dCAPS标记区分异交率大豆雄性不育系 的方法 技术领域 [0001]本发明提供了一种dCAPS标记区分 （高、 低） 异交率大豆雄性不育系的方法， 尤其是 公开了一种利用dCAPS标记区分大豆RN型细胞质雄性不育系异交率高或者低的方法， 用于 鉴定大豆细胞质雄 性不育系异交率的高或者低， 属于农作物分子标记检测技 术领域。 背景技术 [0002]大豆杂种优势利用落后于玉米、 高粱、 水稻、 油菜等大田作物。 原因之一是长时间 内没有找到避免母本自交的有效机制 （张井勇， 2018） 。 利用大豆RN型细胞质雄性不育 （Cytoplasmic  male sterility， CMS） 系， 吉林省农业科学院2 003育成了世界上第一个大豆 杂交种 （赵丽梅等， 2004） 。 大豆CMS系统由不育系、 保持系和恢复系组成， 其中雄性不育细胞 质的载体是不育系， 到目前为止， 利用细胞质雄性不育系， 国内已经育成三十余个大豆杂交 种， 其中利用了大豆RN型细胞质雄 性不育系的杂交种超过二十个。 [0003]尽管杂交大豆能大幅度提高产量， 但是大豆杂交制种技术还没有进行广泛的推广 应用， 种子的繁殖量为限制因素。 此外在大豆杂交种创制过程中， 除以不育系作母本同恢复 系为父本进 行杂交可获得杂交种外， 制种还需要繁殖CMS “三系”。 其中保持系和恢复系由于 自身可育， 种子可由自交繁殖获得； 而不育系自身不育， 种子只能通过其作为母本与同型保 持系父本杂交获得。 母本异交结实率低， 造成制种成本高， 选配的优势组合无法利用， 仍是 制约杂交大豆产业 化进程的瓶颈之一， 继而影响大豆 CMS商业化育种工作 （孙寰等， 20 04） 。 发明内容 [0004]本发明提供一种dCAPS标记区分 （高、 低） 异交率大豆雄性不育系的方法， 利用 dCAPS标记区分高、 低异交率大豆细胞质雄性不育系， 能够鉴别选育出多个稳定不育系是否 具有高异交率的性状， 作为准确和可靠的分子生物学实验检测技术和手段， 能够辅助高效 率， 低成本， 减少用低异交率母本进行配制杂交 组合的有效方法。 [0005]本发明提供一种dCAPS标记区分 （高、 低） 异交率大豆雄性不育系的方法， 解决方案 如下： 1） 提取含有RN型雄性不育细胞质的不同异交率大豆不育系种子基因组DNA， 选用 两者间的1对基因组总DNA的SNP衍生出的dCAPS为标记， 标记命名为SNP1， 其对应的部分侧 翼序列为： TACAGCGACAAAGTAATGGGTCTAGCT[G/G和T的杂合位点][高异交率/低异交率]G[G/ C][高异交率/低异交率]A AGCTCATG GAGGTGTTGTCCGAAGCAATGGGGTTAGAGAAAGA； 上述侧翼序列中的G和T的杂合位点是指D NA双链中一条链的位点为G， 其对应另一 条链上的等 位位点为T。 [0006]在SNP1的侧翼序列设计一对引物进行PCR扩增， 引物序列如下： 上游引物序列为： 5 ’ ‑ACAGCGACA AAGTAATGGGTCAAGCT‑3’； 下游引物序列为： 5 ’ ‑  TCTCCAAGATTGACGACGA AGG  ‑3’；说　明　书 1/5 页 3 CN 114959091 A 3