(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210356503.7 (22)申请日 2022.04.06 (71)申请人 湖州申科生物技 术有限公司 地址 313000 浙江省湖州市吴兴区红丰路 1366号3幢10层10 07-1 (72)发明人 吴婉欣　袁小铃　宗伟英　吴晓双　 (74)专利代理 机构 浙江千克知识产权代理有限 公司 33246 专利代理师 雷娴 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物 对及检测方法 (57)摘要 本发明涉及生物检测领域， 尤其涉及用于检 测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对、 及检测 方法， 所述引物对至少包含4组引物对； 其中： 各 引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结 合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示区 段； 各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别 为100bp以下、 100 ‑200bp、 200 ‑500bp以及500bp 以上。 本发明能够用于分析流感疫苗中间品、 成 品中的MDC K残留DNA片段， 有利于改进工艺、 提高 产品质量， 用于产品质量控制和放行。 同时利用 所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷， 从获 得样本到给出检测报告只需4h； 灵敏度高， 定量 限均为30  fg/rxn； 专属性强， 能区分E.coli、 CHO 细胞、 NS0细胞、 Vero细胞、 毕赤酵母或人类等干 扰性DNA。 权利要求书2页 说明书10页 序列表3页 附图5页 CN 114622005 A 2022.06.14 CN 114622005 A 1.用于检测MDCK细胞DNA片段 大小分布的引物对， 其特 征在于， 至少包含4组引物对； 其中： 各引物对中的正向引 物和反向引物分别特异性结合于MDCK细胞基因组DNA  上SEQ ID  NO:1所示区段； 各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、 100 ‑200bp、 200 ‑500bp以及 500bp以上。 2.根据权利要求1所述用于检测MDCK细胞DNA片段 大小分布的引物对， 其特 征在于， 所述引物对选自以下引物对： 第一引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 774‑816位； 所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第832 ‑876 位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为74 ‑94bp； 第二引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 732‑773位； 所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第850 ‑893 位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为132 ‑152bp； 第三引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 746‑786位； 所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第9 31‑969 位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为194 ‑214bp； 第四引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 746‑786位； 所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第1227 ‑ 1269位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为 494‑514bp。 3.根据权利要求1或2中任意一项用于检测MDCK细胞DNA片段大小分布的引物对， 其特 征在于， 所述引物对选自以下引物对： 第一引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 784‑806位； 所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第842 ‑866 位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为84bp； 第二引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 742‑763 位； 所述反向引 物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第860 ‑ 883位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为142bp； 第三引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 756‑776 位； 所述反向引 物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第941 ‑ 959位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为204bp； 第四引物对， 其中的正向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第 756‑776位； 所述反向引物结合于MDCK细胞基因组DNA上SEQ  ID NO:1所示序列的第1237 ‑ 1259位， 并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为5 04bp。 4.根据权利要求3所述用于检测MDCK细胞DNA片段 大小分布的引物对， 其特 征在于， 所述第一引物对的正向引物如SEQ  ID NO:4所示， 反向引物如SEQ  ID NO:5所示； 所述第二引物对的正向引物如SEQ  ID NO:2所示， 反向引物如SEQ  ID NO:6所示； 所述第三引物对的正向引物如SEQ  ID NO:3所示， 反向引物如SEQ  ID NO:7所示；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114622005 A 2所述第四引物对的正向引物如SEQ  ID NO:3所示， 反向引物如SEQ  ID NO:8所示。 5.用于检测MDCK细胞DNA片段 大小分布的引物对的组合， 其特 征在于， 所述引物如权利要求2~4中任意一项所示， 且至少包括下述组合： 所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对； 所述第一引物对+所述第二引物对+所述第四引物对； 所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对。 6.用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂， 其特 征在于， 所述检测试剂包括如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的 引物对的组合。 7.根据权利要求6所述的用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂， 其特 征在于， 还包括探针。 8.根据权利要求7 所述的用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂， 其特 征在于， 所述探针如SEQ  ID NO:9所示。 9.用于检测MDCK细胞残留DNA的检测试剂盒， 其特 征在于， 其包含如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组 合或者6~8中任意一项所述的检测试剂。 10.一种MDCK细胞残留DNA的检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 利用如权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的 引物对的组合或者6~8中任意一项 所述的检测试剂或者权利要求9所述的检测试剂盒， 对待 测样品进行qPCR， 并检测qPCR扩增产物。 11.权利要求1~4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5所述的引物对的组合或者 6~8中任意一项 所述的检测试剂或者权利要求9所述的检测试剂盒的用途， 用于检测待测对 象中是否存在MDCK细胞残留DNA及其片段 大小分布。 12.根据权利要求1 1所述的用途， 其特 征在于， 所述待测对象选自基于MDCK细胞基质培育制备的疫苗、 重组蛋白药、 抗体药中的任意 一种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114622005 A 3