(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210359161.4 (22)申请日 2022.04.06 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 粟硕　张乐天　姜智文　周子彤　 孙久萌　盛守志　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 强萌 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状 病毒的四重荧 光定量PCR检测试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测猪流行性腹泻 病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂 盒及其应用， 该试剂盒包括热启动Taq  DNA聚合 酶、 无酶水、 PCR反应液、 探针法荧光定量PCR配套 Buffer， 以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病 毒、 G2基因型猪流行性腹泻病毒、 猪A群轮状病 毒、 猪C群轮状病毒的四对特异性引物和相应的 TaqMan探针及对照品。 本发明的试剂盒实现了在 一个PCR反应管中同时检测四种能够引起猪腹泻 的病毒， 并具有极佳的特异性和重复性， 可直接 应用于猪临床腹泻样品的常规实验室诊断， 为猪 流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的流行病学研究 提供快速、 准确的检测方法。 权利要求书2页 说明书11页 序列表3页 附图3页 CN 114807437 A 2022.07.29 CN 114807437 A 1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的四重荧光定量PCR检测试剂盒， 其 特征在于， 包括热启动Taq  DNA聚合酶、 无酶水、 PCR反应液、 探针法荧光定量PCR配套 Buffer， 以及用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、 G2基因型猪流行性腹泻病毒、 猪A群轮 状病毒、 猪C群轮状病毒的四对 特异性引物和相应的TaqMan探针及对照品； 其中， 所述P CR反 应液含有Mg2+离子、 PCR缓冲液、 dNTPs 混合物； 用于检测G1基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下： PEDV‑G1(F)如SEQ  ID NO.1所示； PEDV‑G1(R)如SEQ  ID NO.2所示； PEDV‑G1‑Probe如SEQ  ID NO.3所示； 用于检测G2基因型猪流行性腹泻病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下： PEDV‑G2(F)如SEQ  ID NO.4所示； PEDV‑G2(R)如SEQ  ID NO.5所示； PEDV‑G2‑Probe如SEQ  ID NO.6所示； 用于检测猪A群 轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下： RVA(F)如SEQ  ID NO.7所示； RVA(R)如SEQ  ID NO.8所示； RVA‑Probe如SEQ  ID NO.9所示； 用于检测猪C群 轮状病毒的引物对及TaqMan探针的核苷酸序列如下： RVC(F)如SEQ  ID NO.10所示； RVC(R)如SEQ  ID NO.11所示； RVC‑Probe如SEQ  ID NO.12所示。 2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病 毒的四重荧光定 量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述对照品包括阳性对照品和阴性对照品， 所述阳性对照 品为带有G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、 猪A群轮 状病毒和猪C群 轮状病毒的VP6基因片段的标准品模板， 所述阴性对照品为无核酶水。 3.根据权利要求2所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病 毒的四重荧光定 量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述标准品模板为分别将G1基因型猪流行性腹泻病毒和G2 基因型猪流行性腹泻病毒的S基因片段、 猪A群轮状病毒和猪C群轮状病毒的VP 6基因片段四 种目的基因扩增， 连入pMD18 ‑T载体， 构建的重组质粒。 4.根据权利要求1所述的一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪轮状病 毒的四重荧光定 量PCR检测试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒保存于 ‑20℃， 并避免反复冻融。 5.权利要求1 ‑4任一项所述的试剂盒在检测G1基因型猪流行性腹泻病毒、 G2基因型猪 流行性腹泻病毒、 猪A群 轮状病毒和猪C群 轮状病毒基因中应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特 征在于， 检测方法包括以下步骤： 步骤1)获取待检样品的cDNA： 提取肛拭子样品、 腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA， 反转录为cDNA模板； 步骤2)使用试剂盒中的四对qPCR引物和相应的TaqMan探针进行检测： 将所述四对qPCR 引物和相应的TaqMan探针置于qPCR反应体系中， 以步骤1)中获得的cDNA作为模板， 进行PCR 扩增， 收集 荧光信号；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807437 A 2步骤3)根据机器测算的荧光信号及Cq值判断样品中是否有PEDV ‑G1(FAM)、 PEDV ‑G2 (Texas Red)、 RVA(CY5)、 RVC(VIC)， Cq值＞3 5的结果判断为阴性。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 步骤1)所述反转录的步骤如下： 使用 Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis  Kit进行， 其反应总体系为20μL， 包括： 1μL   Random hexamers， 1 μL  Oligo(dT)23VN， 5 μL  nuclease ‑free Water， 5 μL总RNA， 混匀后65℃ 加热5min， 冰浴3min， 继续加入： 4 μL  4×gDNA wiper Mix， 混匀后42℃加热2min， 继续加入： 2μL 10×RT Mix、 2μL ⅡEnzyme Mix； 反应程序为： 25℃加热5min， 50℃加热 45min， 85℃加热2mi n， 反应后得到 cDNA模板 。 8.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 步骤2)所述qPCR反应体系如下： 10μL   Probe Master Mix， PEDV ‑G1(F)、 PEDV ‑G1(R)、 PEDV ‑G2(F)、 PEDV ‑G2(R)、 RVA(F)、 RVA(R)、 RVC(F)和RVC(R)各0.3 μL， PEDV ‑G1‑Probe、 PEDV ‑G2‑Probe、 RVA ‑Probe和RVC ‑Probe各0.2 μ L， cDNA模板2 μL， 无核酶水加至体系 总体积为20 μL。 9.根据权利 要求6所述的应用， 其特征在于， 步骤2)所述PCR扩增的反应程序如下： 荧光 通道设置为： 通道1： FAM， 通道2： VIC， 通道3： Texas  Red， 通道4： CY5； 温控程序设置为： 95℃ 预变性10min； 95℃变性10s， 59℃退火10s， 72℃延伸20s， 45个循环； 同时以荧光定量PCR仪 器收集荧光信号。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807437 A 3