(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210371158.4 (22)申请日 2022.04.08 (71)申请人 山东傲农种猪有限公司 地址 256800 山东省滨州市沾化区滨 海镇 河溃村南首 申请人 福建哈客 生态农业有限公司 　 漳州傲农现代农业 开发有限公司 　 福建傲农生物科技 集团股份有限公 司 (72)发明人 张蓉　邓红玉　陈秀萍　凌勇　 丁能水　谢亚磊　万文峰　吴有林　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 覃蛟(51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种猪病毒性腹泻检测引物组合、 检测试剂 盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种猪病毒性腹泻检测引物 组合、 检测试剂盒及应用， 涉及猪病毒性腹泻检 测技术领域。 其包括第一探针引物对、 第二探针 引物对、 第三探针引物对和第四探针引物对。 该 检测引物组合和检测试剂盒可以一次性实现样 本中猪流行性腹泻、 猪传染性胃肠炎、 猪轮状病 毒、 猪德尔塔冠状病毒的检测分析， 使4种病毒基 因的扩增效率一致,且与每个单重反应的灵敏度 一致， 具有简便快捷、 稳定性好、 检测灵敏度高、 特异性强的特点。 提供的检测试剂盒具有检测便 捷、 准确度高、 检测效率高的优势， 可以应用于猪 场日常检测工作， 为猪病毒性腹泻4种临床表现 相似病毒的临床诊断提供技 术支持。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 附图5页 CN 114672595 A 2022.06.28 CN 114672595 A 1.一种猪病 毒性腹泻检测引物 组合， 其特征在于， 其包括第 一探针引物对、 第 二探针引 物对、 第三探针引物对和第四探针引物对， 所述第一探针引物对包括第一探针和第一引物 对， 所述第二探针引物对包括第二探针和第二引物对， 所述第三探针引物对包括第三探针 和第三引物对， 所述第四探针引物对 包括第四探针和第四引物对； 所述第一引物对具有如SEQ  ID NO.1‑2所示的序列， 所述第一探针具有如SEQ  ID NO.3 所示的序列， 所述第二引物对具有如SEQ  ID NO.4‑5所示的序列， 所述第二探针具有如SEQ   ID NO.6所示的序列， 所述第三引物对具有如SEQ  ID NO.7‑8所示的序列， 所述第三探针具 有如SEQ ID NO.9所示的序列， 所述第四引物对具有如SEQ  ID NO.10‑11所示的序列， 所述 第四探针具有如SEQ  ID NO.12所示的序列； 优选地， 所述第一探针、 第二探针、 第三探针和第四探针的5 ’端均标记有荧光报告基 团， 所述第一探针、 第二探针、 第三探针和第四探针的3 ’端均标记有荧 光淬灭基团。 2.一种猪病 毒性腹泻检测试剂 盒， 其特征在于， 其包括权利要求1所述的猪病 毒性腹泻 检测引物组合。 3.根据权利要求2所述的猪病 毒性腹泻检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒中的猪病 毒性腹泻检测引物组合分布于引物预混试剂和探针预混试剂中， 且所述引物预混试剂为第 一引物对、 第二引物对、 第三引物对和 第四引物对的预混试剂， 所述引物预混试剂中第一引 物对、 第二引物对、 第三引物对和第四引物对的混合摩尔比为1:1～1.5:1:1。 4.根据权利要求3所述的猪病 毒性腹泻检测试剂 盒， 其特征在于， 所述探针预混试剂为 第一探针、 第二探针、 第三探针和第四探针的预混试剂， 所述探针预混试剂中第一探针、 第 二探针、 第三探针和第四探针的混合摩尔比为1:1～1.5:1:1。 5.根据权利要求2 ‑4任一项所述的猪病毒性腹泻检测试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒 还包括阳性对照、 阴性对照、 PCR扩增液和酶预混液。 6.一种如权利要求1所述的猪病毒性腹泻 检测引物组合在制备检测测试样本 中猪病毒 性腹泻的试剂盒中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒用于： 将待测样本的RNA与权利 要求1所述的猪病毒性腹泻检测引物组合混合进行反应， 根据荧光信号进行待测样本的结 果判定。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述应用中添加的探针引物对中引物对的 最终摩尔浓度与探针的最终摩尔浓度之比为20 0nM～500nM:100nM。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述应用中， 添加的探针引物对中引物对 的最终总摩尔浓度与探针的最终总摩尔浓度之比为 400nM:100nM。 10.根据权利要求7所述的， 其特征在于， 所述反应的程序包括： 55℃15 ‑18min； 95 ‑96℃ 30s； 95‑96℃10s， 6 0℃25‑30s， 共计40 ‑45个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672595 A 2一种猪病毒性腹泻检测引物组合、 检测试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及猪病毒性腹泻检测技术领域， 具体而言， 涉及一种猪病毒性腹泻检测 引物组合、 检测试剂盒及应用。 背景技术 [0002]猪病毒性腹泻是严重危害养猪业的重要传染病之一， 每年都引发大量仔猪腹泻、 迅速脱水死亡， 且常因多种腹泻病毒混合感染而使病情加重， 导致高死亡率， 造成严重的经 济损失。 病毒性腹泻最主要的病原有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、 猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、 猪轮状病毒(RV)等。 近年来， 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)作为一种新发现的肠道冠 状病毒也常被 检出。 [0003]其中， 猪流行性腹泻(Porcine  epidemic  diarrheavirus， PED)由P EDV引起的一种 急性、 高度接触性传染病， 各种年龄和品种的猪都易感， 其中2周龄以下仔猪的致死率可达 100％。 断奶猪和 育肥猪患病后出现4 ‑6天水样腹泻。 由于该病病 程短， 传播快， 致使该病在 世界各国的传播非常广泛。 [0004]而传染性胃肠炎病毒(Transmissible  gastroenteritis of swine virus， TGEV) 在各种年龄及品种的猪均易感， 患猪主要表现为呕吐、 水样腹泻、 脱水， 该病在世界各养猪 国家均有发生， 给世界养猪业带来了极大的经济损失。 [0005]而猪轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠病毒科， 轮状病毒属。 猪轮状病毒是引起仔 猪病毒性腹泻 常见的病原之一， 主要临床症状表现为黄色水样腹泻并伴 随着呕吐,因该病 流行范围广， 发病率高， 给养猪业带来了极大的经济损失。 [0006]而猪德尔塔冠状病毒(Porcine  deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的肠道 冠状病毒， 临床表现为水样 腹泻和呕吐， 迅速脱 水， 衰竭而 亡。 各阶段猪均可感染， 新生哺乳 仔猪最易感染， 发病率可达 50％～100％， 死亡率高达10 0％。 [0007]目前针对猪病毒性腹泻的检测试剂盒主要是以传统的猪传染性胃肠炎病毒、 猪流 行性腹泻病毒和猪轮状病毒的单重荧光定量P CR检测方法为主， 然而， 病毒性腹泻往往不仅 仅感染单一病毒， 往往是多病毒混合感染， 并且猪德尔塔冠状病毒的新型病毒时有存在， 针 对于此种 病毒目前尚未有成熟的检测方法。 [0008]基于此， 现有的检测猪病毒性腹泻的检测试剂盒并不能满足目前疫病检测的需 求， 因此急需研制符合当前疫情流行趋势的商品化检测试剂盒。 目前尚无荧光定量P CR商品 化试剂盒可以一次性检测鉴别上述四种 病原。 [0009]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0010]本发明的目的在于提供一种猪病毒性腹泻检测引物组合、 检测试剂盒及应用以解 决上述技术问题。 [0011]本发明是这样实现的：说　明　书 1/10 页 3 CN 114672595 A 3